Учебная страница курса биоинформатики,
год поступления 2013

Семестры Студенты Преподаватели

• 2023
• 2022
• 2021
• 2020
• 2019
• 2018
• 2017
• 2016

• ...

Указания

Часть 1: выбор объектов и получение выравнивания

Все домены и доменные архитектуры определяются в соответствии с БД Pfam.

Прочитайте указания до конца, прежде чем начинать работу: есть ряд ограничений на то, какое семейство доменов стоит выбрать для изучения.

• 1. Выбор семейства доменов

Варианты выбора:

• Один из доменов вашего белка с первого курса.
• Другие семейства доменов из доменных архитектур, содержащих домен вашего белка.
• Любой подходящий домен.

Рекомендуемые ограничения на домен

• В семействе Pfam не более 10000 (десяти тысяч) последовательностей (чтобы JalView не тормозил).

• В семействе Pfam представлены последовательности из не более чем 1200 видов (чтобы интерактивное дерево видов генерировалось на сайте Pfam; 1200 – пробовал, открывается; 2500 – пробовал, Pfam отказывается).

• Домены семейства входят как минимум в две разные доменные архитектуры, представленные как минимум парой десятков последовательностей (>20) каждая.

• Желательно: хотя бы для одной последовательности известна 3D структура белка (домена).

Необходимую для выбора домена информацию см. на сайте Pfam (со страницы домена ссылки Domain organisation, Species → Tree, Structures).

Действия

Запустите JalView. Для выбранного семейства доменов:

• Скачайте выравнивание из Pfam (Full): в JalView: File → Fetch Sequences, выбираете БД, указываете AC семейства.

• Раскрасьте по консервативности (ClustalX или BLOSUM62, By conservation, подберите порог консервативности).
• (*)Добавьте 3D структуру одного домена, если таковая имеется:
  • на сайте Pfam найдите соответствие между Uniprot ID и PDB кодами;

  • найдите в выравнивании нужный Uniprot ID (Select → find);

  • свяжите последовательность с PDB кодом (щёлкнуть правой кнопкой мыши по ID, выбрать Structure → Associate structure with sequence → Enter PDB Id);

  • скачайте структуру (View structure в том же меню).
• Сохраните выравнивание как проект (jvp) и в fasta-формате.

  2. Выбор архитектур

Достаточно выбрать две-три архитектуры.

Рекомендуемые ограничения на архитектуру

• Рекомендуем (но не настаиваем) выбирать простые доменные архитектуры – одно-двух-трех доменные.
• Должно быть не менее 20 последовательностей с данной архитектурой, на считая фрагментов.

Рекомендуемые действия

• Получите таблицу с информацией об архитектуре всех последовательностей, содержащих выбранный домен:

  • Файл swisspfam, содержащий эту информацию для всех последовательностей Uniprot, скачан на kodomo (/srv/databases/pfam/swisspfam.gz)

  • скрипт swisspfam_to_xls.py отбирает последовательности с указанным доменом и составляет таблицу для Excel (python swisspfam_to_xls.py -h для изучения списка параметров)

• Составьте список последовательностей с указанием доменной архитектуры. Используйте сводную таблицу в Excel: строки – AC последовательностей, столбцы – домены Pfam.

• В список последовательностей добавьте колонки с информацией о таксономической принадлежности. Для этого:

• Скачайте полные записи всех последовательностей:

  • Uniprot → Retrieve;

  • вводите список AC → Retrieve; сохраняете flat text .

• Получите таксономию:

  • Запустите скрипт uniprot_to_taxonomy.py

    • python uniprot_to_taxonomy.py -i <входной файл в формате Uniprot> -o <выходной файл>

    • python uniprot_to_taxonomy.py -h (для подсказки)

• Перенесите полученную таксономию в основную таблицу с помощью ВПР (VLOOKUP).

• Добавьте колонку с длиной выбранного домена из каждой последовательности.

  3. Выбор таксона и подтаксонов

• Нужно выбрать один таксон и два (можно три) его подтаксона следующего уровня.

Подтаксоны должны быть достаточно представлены последовательностями c выбранными архитектурами (не менее 15 последовательностей с каждой из архитектур в каждом из подтаксонов; если такие подтаксоны и архитектуры подобрать не получается, выберите другое семейство доменов). Рекомендуется в качестве таксона выбрать царство (Archaea, Bacteria, Eukaryota). Другой хороший вариант: взять в качестве таксона все "cellular organisms", а два или все три царства – как подтаксоны. Следует придумать буквенные коды (X,Y,...) для выбранных подтаксонов, чтобы отображать их на листьях дерева.

• 4. Выбор представителей архитектур

Действия

В основной таблице (всех представителей семейства доменов):

• Добавьте колонку для отметки выбранных вами последовательностей.
• Выберите по 20 (лучше несколько более, чтобы было кого выкидывать потом) последовательностей из каждой выбранной архитектуры и отметьте их. Следите за тем, чтобы:
  • домены в выбранных последовательностях имели примерно одинаковую длину (так уменьшается риск взять фрагмент или неправильно выровненную последовательность);
  • было хорошее представительство подтаксонов в выборке.
• (*) Добавьте к выборке последовательность с известной 3D структурой, даже если она не входит в нужные группы (пригодится для проверки выравнивания).

В выравнивании:

• Оставьте только отобранные вами последовательности из всех выбранных архитектур.

  • Используйте скрипт filter_alignment.py (Запустите сначала python filter_alignment.py -h для изучения списка параметров)

• Откройте "профильтрованное" выравнвание в JalView, проверьте, отредактируйте и разметьте полученное выравнивание:

  • удалите пустые колонки (Edit → Remove Empty columns);

  • создайте группы, по одной на каждую архитектуру (выделить имена, правой кнопкой мыши по выделенным последовательностям → Selection → Group → Edit name and description)

  • задайте раскраску в каждой группе (Group → Color → ClustalX или BLOSUM62; затем Group → Color → By conservation и подберите порог)

  • При необходимости, отсортируйте по группам: Calculate → Sort

  • (*) Добавьте разметку по вторичной структуре, исходя из последовательности с известной 3D структурой
  • удалите явные фрагменты
  • удалите те последовательности, которые выровнены явно неправильно

  • (*) на месте спиралей и тяжей, составляющих ядро домена (см. 3D в соответствующем окне JalView) гэпы крайне маловероятны – уберите их, если есть

  • удалите N- и C-концевые участки в том случае, если в них очевидно нет хорошего выравнивания.
• Сохраните как проект (под другим именем, нежели выравнивание всего семейства).

• Проверьте выравнивание!!!. Качество реконструкции филогении напрямую зависит от правильности выравнивания. Убедитесь в (i) отсутствии фрагментов; (ii) отсутствии последовательностей, резко отличающихся от выравнивания в целом – возможно, Pfam нашел в них домен ошибочно; (iii) отсутствии явных ошибок в выравнивании - программы множественного выравнивания нередко справляются с задачей не идеально, что видно на глаз.

Часть 2: построение филогенетического дерева домена

Построение дерева по выравниванию последовательностей многодоменных белков с разной доменной архитектурой бессмысленно, так как, очевидно, сходство по домену, которого нет в последовательностях с другой доменной архитектурой, обеспечит разделение на ветви по доменным архитектурам вне зависимости от хода эволюции.

• Сделайте имена последовательностей говорящими. А именно:
  • Закодируйте доменные архитектуры (например, 1 и 2, если выбраны однодоменные и двудоменные белки).

  • Закодируйте сравниваемые таксоны (например, E, A и B – если рассматриваются эукариоты, археи и бактерии). Расшифровка кодов архитектур и таксонов на странице с отчётом обязательна!

  • К именам всех последовательностей спереди добавьте коды архитектуры и таксона (например, так: 2_E_Q9XWZ6 вместо Q9XWZ6_CAEEL/290-607)

• Постройте филогенетическое дерево:
  • Используйте любой из методов "верхней тройки" программы MEGA. Вместо этого можно, если хотите, использовать метод NJ из Jalview, программы пакета PHYLIP или какой-нибудь онлайн-сервис (но выбранный метод не должен предполагать молекулярные часы и должен выдавать длины ветвей). Обязательно опишите программу, метод и использованные параметры в отчёте.
  • (* – дополнительно) Используйте известные вам методы подтверждения достоверности ветвей дерева

  • Создайте рисунок дерева с использованием методов выделения (раскраски и т.п.) ветвей и/или клад для наглядной демонстрации результата, поместите его на страницу отчёта. Можно использовать MEGA или любые другие программы визуализации дерева, представляющие достаточные средства для визуализации. Одна из таких программ — ITOL

  • Также поместите на странице отчёта скобочную формулу дерева.
  • При описании эволюции доменной архитектуры придерживайтесь принципа парсимонии (т.е. экономии предполагаемых эволюционных событий).

Часть 3: профиль

• Подсемейство хорошее, если:
  • оно является кладой на дереве;
  • по доменной архитектуре, таксономической принадлежности или по диагностическим позициям или признакам в последовательности вы сможете решить про любой белок с вашим доменом, принадлежит ли он подсемейству или нет;
  • это в идеале ...
• Извлеките представителей подсемейства из выравнивания и сохраните в отдельном файле.

• Для построения профиля используйте пакет HMMER. Он установлен на kodomo. Подсказка ко всем трём программам даётся опцией -h. Более подробную информацию можно получить, выполнив команду man hmm2build (аналогично с hmm2calibrate и hmm2search).

• Постройте профиль программой hmm2build.

• Откалибруйте профиль программой hmm2calibrate

• Проведите поиск по всем белкам Uniprot, включающим ваш домен, программой hmm2search, используя откалиброванный профиль. Вам понадобится файл в fasta-формате со всеми белками Uniprot, включающими хоть один домен из вашего Pfam-семейства.

• Сравнивать списки можно средствами Excel или Python. Приведите ссылки на исходные списки и на средства работы с ними (книгу Excel или скрипт).

Дополнительная информация

На kodomo, помимо пакета HMMER 2.3.2, установлен более новый пакет HMMER 3.0. Его программы отличаются отстутсвием двойки в названии (например, hmmbuild вместо hmm2build). К сожалению, hmmbuild не принимает выравнивания в обычных форматах (fasta, aln, msf), поэтому с hmm2build работать проще. Впрочем, Jalview умеет сохранять выравнивания в стокгольмском формате, который hmmbuild понимает, поэтому можете работать с ним (или даже, как дополнительное задание, сравнить результаты работы старого и нового пакетов). Калибровка профиля в HMMER 3.0 не требуется.