Программы пакета BLAST для работы с нуклеотидными последовательностями

  1. Поиск в геноме участков, кодирующих белки, похожие на заданный

    Заданным белком является белок из Escherichia coli K-12 с известной аминокислотной последовательностью. Требовалось определить, закодированы ли похожие белки в геноме организма Pasteurella multocida.
    Сперва в рабочей директории создавались индексные файлы пакета BLAST для поиска по заданному геному.
    (formatdb -i pm_genome.fasta -p F -n pm)
    Далее через Putty запускалась программа TBLASTN из пакета BLAST так, чтобы поиск велся с порогом на E-value 0,001.
    (blastall -p tblastn -d pm -i iscs_ecoli.fasta -o output.txt -e 0.001)
    Результат выполнения данной команды находится, соответственно, в файле output.txt. В общем, он характеризуется следующими данными:

    Поиск гомологов белка iscs_ecoli в геноме бактерии Pasteurella multocida
    Число находок с Е-value<0,001 2
    Характеристика лучшей находки:  
       E-value находки 0.0
    AC соответствующей записи EMBL AE006068
    Координаты выравнивания в записи EMBL 582 - 1793
    Координаты CDS в записи EMBL 582 - 1796

  2. Аналогичный поиск сразу в нескольких геномах

    Теперь такой же поиск ведется одновременно по трем геномам: как и в предыдущем упражнении, по полному геному бактерии Pasteurella multocida, а также по геномам Salmonella typhimurium и Xanthomonas campestris.
    Результат поиска представляет собой файл output_all.txt

    Можно отметить некоторые различия между результатами, полученными в этом и в предыдущем упражнениях.
    В предыдущем упражнении было всего 2 находки с E-value меньше 0,001. Лучшая из них, с AC AE006068 в EMBL, имела E-value 0.0 и Score 659.
    Поиск в нескольких геномах выдал 11 находок, среди которых присутствует AE006068 с теми же значениями E-value и Score. Однако в этом случае она не является лучшей: находка с AC AE006468 имеет значение Score 757.
    Оба эти варианта поиска обнаружили и ген AE006126, принадлежащий, естественно, бактерии Pasteurella multocida. И для него отличается значение E-value, выданное программой в двух упражнениях. В первом случае, когда поиск велся только по геному этой бактерии, оно было равно 8e-23, тогда как при втором поиске увеличивается до 4e-22.

  3. Поиск гомологов с помощью программы BLASTN

    Для выполнения упражнения сначала нужно было получить fasta-файл с последовательностью из генома E.coli, кодирующей белок.
    Для этого в записи Swiss-Prot искали ссылки на банк EMBL, по данному номеру получали соответствующую запись EMBL, в ней находили нужное CDS и оттуда брали координаты участка для вырезания. Вырезался участок программой seqret, в результате чего была получена следующая нуклеотидная последовательность, которая кодирует определенную аминокислотную.

    Белок ISCS_ECOLI - это Cysteine desulfurase, также синоним названия - NifS protein homolog, указано и название кодирующего гена (iscS). С помощью системы SRS нашли информацию о функциях этого белка: Catalyzes the removal of elemental sulfur and selenium atoms from cysteine and selenocysteine to produce alanine. Functions as a sulfur delivery protein for NAD, biotin and Fe-S cluster synthesis. Transfers sulfur on 'Cys-456' of thiI in a transpersulfidation reaction. Transfers sulfur on 'Cys-19' of tusA in a transpersulfidation reaction. Functions also as a selenium delivery protein in the pathway for the biosynthesis of selenophosphate.

    Мы искали гомологов гена iscs_ecoli в геномах трех бактерий при помощи программы BLASTN. На вход программе подавалась нуклеотидная последовательность соответствующего гена. В результате BLASTN выдал следующий файл (без ограничения E-value) и другой, со значением E-value меньше 0.001.

    Лучшая находка такого поиска имеет значение E-value, равное 0.0 и Score - 1378. Эти показатели значительно отличаются от показателей всех последующих находок: Score второй из них составляет всего 74. Это, по-видимому, говорит о том, что фактически был найден 1 ген, гомологичный заданному.
    Рассмотрим соответствующее выравнивание: 

    Query: 1     atgaaattaccgatttatctcgactactccgcaaccacgccggtggacccgcgtgttgcc 60
             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 17399 atgaaattaccgatttatctcgactactccgcaaccacgccggtggacccgcgtgttgcc 17340

                                                                         
Query: 61    gagaaaatgatgcagtttatgacgatggacggaacctttggtaacccggcctcccgttct 120
             |||||||||||||||||| ||||  |||||||||||||||| |||||||| || ||||| 
Sbjct: 17339 gagaaaatgatgcagtttctgaccctggacggaacctttgggaacccggcgtctcgttca 17280

                                                                         
Query: 121   caccgtttcggctggcaggctgaagaagcggtagatatcgcccgtaatcagattgccgat 180
             ||||||||||||||||||||||||||||| || ||||||||||| || |||||||| || 
Sbjct: 17279 caccgtttcggctggcaggctgaagaagccgtcgatatcgcccgcaaccagattgctgaa 17220

                                                                         
Query: 181   ctggtcggcgctgatccgcgtgaaatcgtctttacctctggtgcaaccgaatctgacaac 240
             ||||||||||| || ||||||||||||||||||||||| || || || || ||||| |||
Sbjct: 17219 ctggtcggcgccgacccgcgtgaaatcgtctttacctcaggggcgacggagtctgataac 17160

                                                                         
Query: 241   ctggcgatcaaaggtgcagccaacttttatcagaaaaaaggcaagcacatcatcaccagc 300
             |||||||| ||||| || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 17159 ctggcgattaaaggcgctgccaacttttatcagaaaaaaggcaagcacatcatcaccagc 17100

                                                                         
Query: 301   aaaaccgaacacaaagcggtactggatacctgccgtcagctggagcgcgaaggttttgaa 360
             || ||||| ||||||||||| ||||| |||||||||||||| ||||||||||| ||||||
Sbjct: 17099 aagaccgagcacaaagcggtgctggacacctgccgtcagcttgagcgcgaagggtttgaa 17040

                                                                         
Query: 361   gtcacctacctggcaccgcagcgtaacggcattatcgacctgaaagaacttgaagcagcg 420
             || ||||||||||| |||||||| |||||||| ||||| || || || || |||||||||
Sbjct: 17039 gtgacctacctggcgccgcagcgcaacggcatcatcgatctcaacgagctcgaagcagcg 16980

                                                                         
Query: 421   atgcgtgacgacaccatcctcgtgtccatcatgcacgtaaataacgaaatcggcgtggtg 480
             ||||||||||||||||| || || |||||||||||||| || ||||||||||||||||||
Sbjct: 16979 atgcgtgacgacaccattctggtttccatcatgcacgtgaacaacgaaatcggcgtggtg 16920

                                                                         
Query: 481   caggatatcgcggctatcggcgaaatgtgccgtgctcgtggcattatctatcacgttgat 540
             |||||||||||| | ||||||||||||||||| || || || || ||||| |||||||||
Sbjct: 16919 caggatatcgcgaccatcggcgaaatgtgccgcgcgcgcggtatcatctaccacgttgat 16860

                                                                         
Query: 541   gcaacccagagcgtgggtaaactgcctatcgacctgagccagttgaaagttgacctgatg 600
             || |||||||||||||| |||||||||||||| ||||||||  ||||||| || ||||||
Sbjct: 16859 gccacccagagcgtgggcaaactgcctatcgatctgagccaactgaaagtggatctgatg 16800

                                                                         
Query: 601   tctttctccggtcacaaaatctatggcccgaaaggtatcggtgcgctgtatgtacgtcgt 660
             || ||||||||||| ||||| ||||| |||||||| || || ||||||||||| ||||||
Sbjct: 16799 tccttctccggtcataaaatttatggtccgaaaggcattggcgcgctgtatgtgcgtcgt 16740

                                                                         
Query: 661   aaaccgcgcgtacgcatcgaagcgcaaatgcacggcggcggtcacgagcgcggtatgcgt 720
             || |||||  | ||||| |||||||| ||||| |||||||| ||||| ||||||||||| 
Sbjct: 16739 aagccgcgtattcgcattgaagcgcagatgcatggcggcgggcacgaacgcggtatgcgc 16680

                                                                         
Query: 721   tccggcactctgcctgttcaccagatcgtcggaatgggcgaggcctatcgcatcgcaaaa 780
             || || ||||||||||| |||||||| ||||| |||||||| || || || ||||| |||
Sbjct: 16679 tctggtactctgcctgtccaccagattgtcggcatgggcgaagcttaccgtatcgcgaaa 16620

                                                                         
Query: 781   gaagagatggcgaccgagatggaacgtctgcgcggcctgcgtaaccgtctgtggaacggc 840
             |||||||||| |||||| ||||  ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 16619 gaagagatggagaccgaaatggcccgtctgcgcggtctgcgtaaccgtctgtggaacggc 16560

                                                                         
Query: 841   atcaaagatatcgaagaagtttacctgaacggtgacctggaacacggtgcgccgaacatt 900
             ||||||||||| |||||||||||||||||||| ||||| || || || ||||| ||||||
Sbjct: 16559 atcaaagatattgaagaagtttacctgaacggcgaccttgagcagggcgcgccaaacatt 16500

                                                                         
Query: 901   ctcaacgtcagcttcaactacgttgaaggtgagtcgctgattatggcgctgaaagacctc 960
             |||||||| ||||| |||||||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||||| 
Sbjct: 16499 ctcaacgtgagctttaactacgttgaaggcgagtcgctgatcatggcgctgaaagacctg 16440

                                                                         
Query: 961   gcagtttcttcaggttccgcctgtacgtcagcaagcctcgaaccgtcctacgtgctgcgc 1020
             || || ||||| ||||||||||| || || || || || |||||||||||||||||||| 
Sbjct: 16439 gcggtctcttccggttccgcctgcacctccgccagtctggaaccgtcctacgtgctgcgt 16380

                                                                         
Query: 1021  gcgctggggctgaacgacgagctggcacatagctctatccgtttctctttaggtcgtttt 1080
             ||| ||||  |||| ||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 16379 gcgttgggcatgaatgacgaactggcgcatagctctatccgtttctctttaggtcgtttt 16320

                                                                         
Query: 1081  actactgaagaagagatcgactacaccatcgagttagttcgtaaatccatcggtcgtctg 1140
             || |||||||||||||||||||||||||| ||  | |||||||||||||| || ||||||
Sbjct: 16319 accactgaagaagagatcgactacaccattgatctggttcgtaaatccattggccgtctg 16260

                                                                         
Query: 1141  cgtgacctttctccgctgtgggaaatgtacaagcagggcgtggatctgaacagcatcgaa 1200
             |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||
Sbjct: 16259 cgtgacctttctccactgtgggaaatgtacaagcagggtgtggatctgaacagcatcgaa 16200

                            
Query: 1201  tgggctcatcattaa 1215
             ||||| |||||||||
Sbjct: 16199 tgggcacatcattaa 16185
    Для него Identities составляет 89%, что является довольно неплохим показателем. Исходная последовательность выровнена полностью: с 1 по 1215 нуклеотиды. Последовательность Sbjct, соответственно, с 17399 по 16185. Пользуясь этими данными, а также AC находки в EMBL (AE008815) можно найти запись поля cds из документа банка EMBL, описывающую полученный фрагмент генома. Выясняется, что последовательность представляет собой ген nifS, кодирующий белок putative cysteine desulfurase (putative aminotransferase class-V) со следующей последовательностью, AC UniProt Q0W2W6 .

    В сравнении с результатами предыдущего упражнения (когда на вход программе подавалась аминокислотная последовательность белка) находок в этом упражнении (теперь на вход подается нуклеотидная последовательность гена) при ограничении на E-value оказалось значительно меньше - всего 2. Они совпадают с первыми двумя находками поиска в предыдущем упражнении. Для лучшей из них - из бактерии Salmonella typhimurium LT2 - в двух случаях различаются значения Score. При выравнивании нуклеотидных последовательностей заданного гена и найденного гена этой бактерии процент идентичности равен 89%, совпадают 1085 из 1215 нуклеотидов. При выравнивании же соответствующих аминокислотных последовательностей совпадают 381 из 404 аминокислотных остатков, что соответствует 95% идентичности.