Назад

    Функции, продолжение. Ферменты и метаболические пути.

  1. Код заданного фермента

    2. В базе данных UNIPROT с описанием белка ASPA_ECOLI находим EC код фермента:
    EC 4.3.1.1
    Для получения информации об этом коде воспользуемся ссылкой International Union of Biochemistry and Molecular Biology и далее следуем по ссылкам - в соответствии с кодом фермента.
    EC 4 		Lyases                     Лиазы(ферменты, катализирующие расщепление связей С-С, С-О, С-N или др.,
					   сопровождающееся образованием двойных связей, а также обратные реакции - 
					   присоединения по двойным связям или образовывающие связи без участия 
					   окислительно-восстановительных процессов или гидролиза)
EC 4.3	 	Carbon-Nitrogen Lyases     Углерод-азот лиазы(расщепление связи C-N)
EC 4.3.1 	Ammonia-Lyases             Аммиак-лиазы
EC 4.3.1.1 	Aspartate ammonia-lyase    Аспартат-аммиак-лиазы(дезаминирование аспартата)


Катализируемая реакция: L-аспартат = фумарат + NH3
    

    

    рисунок взят из БД BRENDA
    

    Другие названия фермента: aspartase; fumaric aminase; L-aspartase; L-aspartate ammonia-lyase
Систематическое название: L-aspartate ammonia-lyase (fumarate-forming)
Ссылки на БД: BRENDA, EXPASY, GTD, KEGG, PDB, CAS registry number: 9027-30-9
    Этому коду соответствуют 2 записи PBD:
    1j3u (организм Bacillus sp. YM55-1, длина 468, Uniprot: Q9LCC6),
    1jsw (организм Escherichia coli (strain K12), длина 478, Uniprot: P0AC38 )

  2. Метаболические пути, в которых участвует изучаемый фермент.

    3. В документе UNIPROT с описанием белка ASPA_ECOLI имя локуса его гена: b4139 или JW4099.
    На главной страничке БД KEGG провели поиск гена по названию его локуса "eco:b4139" (в KEGG идентификатор штамма Escherichia coli K12 - eco).

    Описание метаболических путей 

    ID                   Definition
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
eco00250             Alanine, aspartate and glutamate metabolism - Escherichia coli K-12 MG1655     метаболизм аланина, аспартата, глутамата
eco00910             Nitrogen metabolism - Escherichia coli K-12 MG1655 			    метаболизм азота
eco01100             Metabolic pathways - Escherichia coli K-12 MG1655 				    метаболические пути
    Графический файл с картой пути eco00250

  3. Структурные формулы соединений L-лизин и ацетил-СоА в KEGG

    4. На странице оглавления KEGG находим ссылку на базу данных химических соединений.
    Провели поиск по L-лизин(L-Lysine) и ацетил-СоА(acetyl-CoA). 

    			L-лизин:						     ацетил-СоА:
английское 		
название:		L-Lysine (Lysine acid; 2,6-Diaminohexanoic acid)	Acetyl-CoA (Acetyl coenzyme A)
идентификатор: 		C00047 							C00024     
структурная формула: 	C6H14N2O2 						C23H38N7O17P3S

                             				        
										полная структура

  4. Метаболический путь между L-лизином и ацетил-СоА

    5. Для поиска реактантов (интермедиатов или лигандов), а также ферментов в БД KEGG Pathway есть два инструмента: "Search objects in pathways" и "Color objects in pathways". Будем работать со вторым.

    В поле запроса ввели найденные в упр.3 идентификаторы соединений. Первое соединение раскрасили красным, а второе - зеленым, промежуточные соединения (кратчайший путь)- желтым, другие возможные пути (более длинные) отмечены другими цветами.

    Было найдено несколько путей, при том как от L-лизина к ацетил-СоА, так и наоборот.

    Цепочка ферментативных реакций 1 (9 интермедиатов):

    путь: биосинтез лизина
    цепочка: ацетил-СоА→L-лизин

    Графический файл с картой пути.

    В данном примере желтым отмечен кратчайший путь, но он не реализуется из-за недостатка 5 ферментов. Реализуется другой путь, более долгий(отмечен розовым, переходит в желтый).

    Цепочка ферментативных реакций 2:

    путь: распад лизина
    цепочка: L-лизин→ацетил-СоА

    Графический файл с картой пути.

  5. Сравнение метаболических путей у разных организмов

    6. Общая карта биосинтеза L-лизина была переведена в режим, соответствующий выбранному организму. По результатам заполнена таблица.

    Возможность выбранной цепочки ферментативных в разных организмах с известными полными геномами.
    Организм Возможна ли цепочка реакций
    (да/нет/неизвестно)    		 Обоснование
    Escherichia coli K-12 MG1655 нет отсутствуют все ферменты, необходимые для осуществления цепочки реакций
    Archaeoglobus fulgidus нет отсутствуют все ферменты, необходимые для осуществления цепочки реакций
    Arabidopsis thaliana нет отсутствуют все ферменты, необходимые для осуществления выбранной цепочки реакций
    Homo sapiens нет отсутствуют 6 ферментов, необходимых для осуществления цепочки реакций

    Как показывает результат, ни в одном из предложенных организмов нет выбранной цепочки ферментативных реакций. Вероятно, это связано с недостаточной степенью исследования ферментов, необходимых для осуществления этой цепочки реакций.

  6. Сравнение ферментов из далеких организмов

    1. С помощью запроса к SRS находим ферменты с кодом ЕС2.7.7.1 у человека и археи Archaeoglobus fulgidus.

      ЕС2.7.7.1 - никотинамиднуклеотид-аденилилтрансфераза;
      реакция: ATP + nicotinamide ribonucleotide = diphosphate + NAD+

      запрос: (([uniprot-ID:*_arcfu] | [uniprot-ID:*_human]) & [uniprot-ECNumber:2.7.7.1])

      Было найдено 4 белка, три из которых - у человека: 

      NMNA1_HUMAN, NMNA2_HUMAN, NMNA3_HUMAN;

      один - у археи Archaeoglobus fulgidus: 
      NADM_ARCFU.

      При поиске нужно снять опцию использования маски, чтобы исключить лишние находки.

    2. Сравнение доменной организации (по PFAM) найденных белков. Для этого используем режим SW_InterProMatches. для просмотра находок.

      Для всех белков найден единственный домен: 

       
PFAM 	PF01467 	цитидилилтрансфераза(Cytidylyltransferase)
код этого фермента EC:2.7.7
В InterPro Relationships указано, что никотинамиднуклеотид-аденилилтрансфераза относится к дочерним ферментам

Children: IPR006418 Nicotinamide-nucleotide adenylyltransferase, archaeal type

      Если осуществлять поиск по ID белков, то PFAM выдает тот же домен, но у каждого белка своя длина этого домена. Также в поле Description для белков из организма человека указан еще один код EC 2.7.7.18 (nicotinate-nucleotide adenylyltransferase).

      Для дальнейшей работы были выбраны домены

      NMNA1_HUMAN(279aa)

      NADM_ARCFU(174aa)

    3. Определение % совпадения последовательностей гомологичных доменов из археи и человека.

      Построили выравнивание последовательностей двух доменов белков NMNA1_HUMAN и NADM_ARCFU: domain.needle 


      Идентичность последовательностей 13.3%

NADM_ARCFU         1 ------------------------MRAFFVGRFQPYHLGHHEVVKNVLQK     26
                                             :|.|.:.:......|.:.|||.::..
NMNA1_HUMAN        1 MENSEKTEVVLLACGSFNPITNMHLRLFELAKDYMNGTGRYTVVKGIISP     50

NADM_ARCFU        27 VDELIIGIGSAQESHSLENPFTAGERVLMIDRAVDEIK------------     64
                     |       |.|.:...|   ..|..||:|.:.|....|
NMNA1_HUMAN       51 V-------GDAYKKKGL---IPAYHRVIMAELATKNSKWVEVDTWESLQK     90

NADM_ARCFU        65 ----------------------------------------------RELG     68
                                                                   ::..
NMNA1_HUMAN       91 EWKETLKVLRHHQEKLEASDCDHQQNSPTLERPGRKRKWTETQDSSQKKS    140

NADM_ARCFU        69 IDKKVYIIP----------LEDIYRNSLWVAH-VCSMVPPFDVVYTN---    104
                     ::.|...:|          ||.....:||.:. :..:|..:.::...
NMNA1_HUMAN      141 LEPKTKAVPKVKLLCGADLLESFAVPNLWKSEDITQIVANYGLICVTRAG    190

NADM_ARCFU       105 ---NPLVYR---LFKEAGFKVMHTKMYNRNEYHGTEIRRKMLEGEDWEKY    148
                        ...:|.   |:|... .:.....:..|:...|:|||.:..|:.....
NMNA1_HUMAN      191 NDAQKFIYESDVLWKHRS-NIHVVNEWIANDISSTKIRRALRRGQSIRYL    239

NADM_ARCFU       149 VPESVAEIIKEIDGIKRLRDISGRDF------------------    174
                     ||:.|.|.|::    ..|......|.
NMNA1_HUMAN      240 VPDLVQEYIEK----HNLYSSESEDRNAGVILAPLQRNTAEAKT    279

    4. С помощью инструментов KEGG найти для выбранного человеческого белка лучшего ортолога из архей, а для архейного –- лучшего ортолога у эукариот.

      Интересно, что в Uniprot для белка NADM_ARCFU имя локуса AF_2315, если осуществлять поиск по этому имени, то находка явно странная: AF_2315,
      не имеет никакого отношения к исходному белку и организму.
      Если же искать AF2315, тогда имеем подходящий результат: AF2315. 

      Лучший ортолог из эукариот для гена белка NADM_ARCFU
				       
KEGG ID: afu:AF2315 
ген: BC1G_14085(белок гипотетический)
организм: Botryotinia fuckeliana B05.10
длина: 245
идентичность: 0.327

рассмотрим еще одну находку (с реальным продуктом):

ген: 100197028 ( сходен с АТФ-зависимой ДНК хеликазой PIF)
организм: Hydra magnipapillata
длина: 1559
идентичность: 0.298

Лучший ортолог из архей для гена белка NMNA1_HUMAN не найден.

Если выбрать не Best-best при поиске, а Forward-Best:
 
KEGG ID: hsa:64802 (279 a.a.)
ген: MFS40622_1131 (белок гипотетический)   
организм: Methanocaldococcus sp. FS406-22
длина: 447
идентичность: 0.237


ген: Nmar_1577 (термосома - шаперонный белковый комплекс)   
организм: Nitrosopumilus maritimus
длина: 540
идентичность: 0.250

      Как можно заметить, идентичность последовательностей довольно низкая, но наблюдается некоторое сходство доменной структуры, которое, видимо, указывает на сохранение функции даже в таких далеких организмах.
      По результатам видно, что самые лучшие находки - гены, продукты которых - гипотетические белки, что, вероятно, связано с недостаточной изученностью организмов и соответствующих белков.






    © Ксения Лежнина 2008-2010