Метаболические пути. KEGG.

Задание № 1. Поиск графических формул и идентификаторов лейцина и ацетил-КоА в KEGG.

Задание №2. Поиск метаболического пути катаболизма аминокислоты лейцина до ацетил-КоА.

C00123 red
C00024 red
2.6.1.42 yellow
2.6.1.6 yellow
1.2.1.25 yellow
1.3.99.10 yellow
6.4.1.4 yellow
4.2.1.18 yellow
2.3.3.10 yellow
1.4.1.9 orange
1.2.4.4 orange
2.3.1.- orange
1.3.99.3 orange
4.1.3.4 orange

Катаболизм лейцина до ацетил-КоА (фрагмент). Полная метаболитическая карта называется "катаболизм лейцина, валина и изолейцина"

Задание № 3. Исследование катаболизма лейцина до ацетил-КоА.

Катаболизм лейцина до ацетил-КоА. Обратимая стадия отмечена красным цветом. Используемые названия метаболитов: 2-кетоизокапроновая кислота = 4-метил-2-оксопентаноат; изовалерил-КоА = 3-метилбутаноил-КоА; 2-метилкротонил-КоА = 3-метилбут-2-еноил-КоА

• Целиком, вместе с кратчайшим и альтернативным путями, эта схема вполне может реализоваться у высших эукариот, например homo sapiens. Действительно, достаточно взять во внимание тот факт, что в общем эволюция ферментативных систем от прокариот к эукариотам могла бы идти по нескольким направлениям (это только предположение):
  1. редукция или значительное упрощение ферментативных циклов и систем анаболизма определенных метаболитов, которые можно в избытке получать из окружающей среды или/и продуктов питания (например, у homo sapiens фактически отсутствуют схемы синтеза незаменимых аминокислот, значительно редуцированы механизмы синтеза непредельных жирных кислот, таких как омега-кислоты: линоленолевая и линолевая кислоты и др. [именно поэтому полезно есть рыбу и салаты, заправленные оливковым маслом!!:)]). Если в катаболизме отсутствуют ферменты (точнее гены этих ферментов), катализирующие определенные стадии, то это объясняется либо тем, что катаболизм данного субстрата протекает в симбионтах (например, как у жвачных происходит усваивание клетчатки растений: её расщепляют находящиеся в специальных отделах многокамерного желудка симбиотические бактерии), либо этот субстрат настолько важен для организма, что простейшие строительные блоки - ацетил-КоА, он получает из расщепления альтернативных источников или из клеток хозяина (если исследуемый организм - паразит).
  2. упрощение (может и усложнение) ферментативных каскадов за счет объединения гомологичных прокариотических систем ферментов в один крупный комплекс (например, пируват декарбоксилазный комплекс, сукцинат дегидрогеназный комплекс, состоящие из трех функционально различных субъединиц, заточенных на выполнение определенной стадии превращения субстрата в целевой продукт [пируват -> ацетил-КоА], которые у прокариот выполняют три различных фермента), или многодоменную структуру, реализуемую в последовательности одного белка. Последний процесс может происходить только за счет эволюции генома в сторону слияния последовательностей генов в одну с помощью механизмов кроссинговера (отчасти, поэтому столь эффективно половое размножение с мейотическим делением половых клеток) или же мобильных элементов в составе генома (транспозоны, в частности, могут вырезать целые участки с заключенными в них генами и вставлять в совершенно иное положение в хромосоме, фактически тасуя геном, как карточную колоду. Также, некоторые такие элементы обладают способностью индуцировать синтез расположенных перед ними генов, причем не зависимо от истинного промотора, так как у них есть своя инвертированная последовательность, выполняющая функции промотора). Все выше сказанное необходимо эукариотическому организму в связи с увеличением общего уровня метаболизма, важностью получить как можно больше энергии за короткий промежуток времени.
  3. Объединение ферментов и ферментативных комплексов в единую систему, которая нередко может оканчиваться сама на себя (образование ферментативных циклов).
  4. Объединение, сцепление ферментативных систем и циклов в гиперциклы или гиперсистемы. Причем в некоторых случаях, определенные ферменты одной из системы являются также катализаторами аналогичных стадий других систем, входящих в гиперцикл (гиперсистему).
     Фактически, образуется высокоорганизованная, упорядоченная и самодостаточноя система для утилизации субстратов, расщепления их до элементарных блоков (например, ацетил-КоА)с генерированием аккумулированной в виде химических связей энергии (АТФ - энергетическая валюта клетки), синтеза из этих блоков за счет запасенной энергии необходимых клетке метаболитов и других веществ, обеспечивающих нормальную цитофизиологию и состояние организма в целом.

Так, можно видеть, что вторая стадия кратчайшего пути является объединением двух стадий альтернативного пути. Это позволяет полагать, что фермент, катализирующий эту реакцию, представляет собой либо двухсубъединичную, либо двухдоменную структуру, включающую основные каталитические элементы (а может и аналогичные/гомологичные активные центры) двух ферментов, катализирующих две стадии альтернативного пути. Хотя, на самом деле, ожидания могут не оправдаться, если объединение двух стадий основывается на усложнении или упрощении самого механизма реакции, как и в исследуемом случае: две альтернативные стадии - это окислительный перенос субстрата на липоамид с декарбоксилированием (первая стадия) и дальнейшая трансферазная активность другого фермента, переносящего остаток субстрата на коэнзим А (Co-SH, вторая стадия). Фермент, реализующий кратчайшую стадию, также катализирует окислительное декарбоксилирование субстрата, но переносит остаток сразу на коэнзим, без промежуточных посредников. Ясно реализуется второй принцип: ускорение метаболитической реакции не только за счет катализа, но и упрощения общей схемы реакции.
Третье утверждение демонстрирует тот факт, что изображенные на схеме ферменты собраны в единой системе катаболизма лейцина до "минимальных строительных блоков" - ацетил-КоА. Хоть её и не удается зациклизовать с системой анаболизмом лейцина (так как лейцин - гликогенная аминокислота, синтезируется из пирувата, а, если мне не изменяет память, механизмов повернуть вспять реакцию окислительного декарбоксилирования пирувата до ацетил-КоА или обойти её у эукариотической клетки (по крайней мере) не существует; иначе бы в организм из жиров мог бы получать глюкозу!!), все же третье утверждение также верно для исследуемого метаболитического превращения.
Четвертое утверждение явным образом доказывается наличием "переключательных точек" (или сверочных, если их так можно назвать). Действительно, если посмотреть на название всей метаболитической карты, то можно убедиться, что она представляет собой гиперсистему, составленную из трех систем: катаболизма лейцина, изолейцина и валина. Эти три системы связаны друг с другом реакциями, приводящими к одним и тем же продуктам, причем субстатом для ферментов, катализирующих эти реакции, является субстрат, расположенный в сверочных точках, перед стадиями, например альтернативного пути (как изображено на рисунке), катализируемых в обе стороны (например, первые две из трех, приведенных на схеме). Важно отметить, что такие "обратимые" стадии катализируются неспецифичными ферментами, которые катализируют аналогичные стадии в других системах, входящих в гиперсистему, причем с использованием/образованием аналогичного (а в некоторых случаях - идентичного) по структуре субстрата/продукта. При этом не важно, что сравнивать - субстрат или продукт, так как из идентичных субстратов в ходе одного и того же преврещения образуются идентичные продукты. В этом легко убедиться, посмотрев на изображение полной метаболитической карты, после использования запроса, приведенного выше. Так, фермент 1.3.99.3 катализирует "обратимую" стадию во всех трех системах катаболизма лейцина, валина, изолейцина, используя в качестве субстрата 3-метилбутаноил-КоА, изобутирил-КоА и 2-метилбутаноил-КоА соответственно:



3-метилбутаноил-КоА, изобутирил-КоА и 2-метилбутаноил-КоА соответственно.



Как видно из приведенных структур, у них много общего: идентичны элементы карбоксильного конца субстратов, также очень сходны углеводородные радикалы: в первых двух субстратах есть идентичный изопропильный элемент, в третьем несколько отличный метилэтильный заместитель. Так вот, эти три вещества как раз расположены в сверочных точках своих систем: из них также возможен синтез разветвленных жирных кислот.
Биологический смысл наличия таких точек и "обратимых" ферментативных стадий перед ними в принципе ясен: если в клетке запустился процесс расщепления лейцина, то в зависимости от сценария, возможны следующие процессы:
• Резко поменявшиеся условия требуют от клетки сохранить имеющийся запас лейцина для синтеза белков: ферментативный процесс вступив в первую "обратимую" стадию поворачивается обратно, в сторону образования лейцина, и далее процесс деградации не идет. Вообще, самые первые реакции практически любой ферментативной системы (гликолиз, катаболизм/анаболизм жирных кислот, аминокислот) часто являются очень сильно подверженными регуляции (по принципу обратной связи, клеточной сигнализацией и др). Поэтому и не удивительно наличие трех ферментов на этой стадии, причем один из них катализирует её "обратимо", а два из них - необратимо, и один из этих двух - неспецифично (катализирует аналогичные реакции также в катаболизме валина, изолейцина). То есть, чем больше ферментов, тем больше целей для регулировки, тем тоньше настроена система катаболизма аминокислоты (или другого объекта). Также наличие специфичного фермента для катаболизма лейцина может свидетельствовать о его большой роли в клеточном метаболизме (все же один из самых распространенных строительных блоков белков, часто входит в состав гидрофобного центра глобулы).
• Клетке необходимо синтезировать разветвленные жирные кислоты: запущенный ферментативный каскад доходит до второй сверочной точки и поворачивает в сторону синтеза жирных кислот. Если же процесс зашел на одну стадию вперед, то "обратимость" реакции, следующей за сверочной точкой, позволяет вернуться обратно и сделать все так, как надо. В принципе, это также свидетельствует, что эта стадия также является центром регуляции, так как чтобы возможно было "вернуться обратно", надо инактивировать фермент, катализирующий дальнейшее превращение по пути катаболизма, и также активировать фермент, катализирующий "обратимую" реакцию - тогда по градиенту концентраций продукта он сможет ускорить установление равновесия между продуктом и исходным субстратом на этой стадии.

Четвертое утверждение также обосновывается следующим наблюдением: если открыть изображение полной карты с использованием запроса, указанного выше, то видно, что практически все стадии, приводящие к образованию 3-метилбут-2-еноил-КоА, Метакрилил-КоА, транс 2-метилбут-2-еноил-КоА (соответственно в катаболизме лейцина, валина и изолейцина) катализируются неспецифичными ферментами. То есть до этих метаболитов включительно, все предшествующие промежуточные вещества очень сходны по структуре. И только после них процессы деградации существенно различаются, в зависимости от конечного желаемого клетке продукта. Фактически, эти стадии катализа неспецифичными ферментами и являются местами "сшивок" близких систем. Также это наблюдение подтверждает принцип упрощения ферментативных процессов (конечно, если только изначально они не были такими, какими мы их видим): зачем иметь для каждого метаболита (например, аминокислот) свой специфичный ферментативный аппарат, если можно близким по структуре метаболитам присвоить один такой аппарат, различающийся только в 3-4 ферментах для каждого из метаболита?

• Видно, что человеческий организм имеет все необходимые ферменты для катаболизма лейцина. Понятное дело, что они начинают работать только в самых критических случаях (долгое голодание, истощение запаса углеводов - в основном гликогена, и жиров), так как основной источник аминокислот - белки, а сильное расщепление белков грозит гибелью клеткам.
• Бактерия Escherichia coli вообще не катаболизирует ни одну из аминокислот этого семейства: ни лейцин, ни валин, ни изолейцин. Возможно, это объясняется тем, что в качестве источника ацетил-КоА она использует более "дешевые" субстраты: различные углеводы (глюкоза, арабиноза, фруктоза), жиры и др., либо утилизирует лейцин в каких-то иных метаболитических процессах, не указанных на карте "Катаболизм лейцина, валина и изолейцина".
• Бактерия Pseudomonas aeruginosa PAO1 также не катаболизирует лейцин до ацетил-КоА. Данная бактерия является главным патогеном в хронических легочных инфекциях у больных фиброзным циститом. При инфекции, они проникают в клетки и межклетники легких и образуют в них микроколонии (биофильмы? biofilm), покрытые мукоидной оболочкой, отчего фагоциты и др. клетки иммунной системы не способны противостоять им. (по данным поиска в Google, статья Physiological responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to oxidative stress in controlled microaerobic and aerobic cultures; Wael Sabra1, Eun-Jin Kim1 and An-Ping Zeng1; Microbiology (2002), 148, 3195-3202. Так что возможное объяснение такое: при инвазии, бактерия может использовать необходимые метаболиты (ацетил-КоА), синтезируемые хозяйской клеткой, или использовать другие пути получения ацетил-КоА, если бактерия не проникает внуть клеток хозяина. Например, переваривать внеклеточный матрикс соединительной ткани, богатый пептидогликанами, гликопептидами, коллагеном. Или использовать материал уничтоженных клеток хозяина в ходе иммунного ответа или собствепнными экзотоксинами.
• Для организма Methanococcus janaschii вообще не известны гены катаболизма лейцина, валина и изолейцина. По данным статьи Archae tells all - marine organism Methanococcus janaschii - The Top 100 Science Stories of 1996 - Brief Article, Methanococcus janaschii является организмом, живущим в морских глубинах, относится к археям, в районах серных курильщиков. Питаются выделяемым из термоисточников водородом, а в качестве продукта жизнедейтельности выделяют метан. Как видно из этого краткого описания, архея живет в совершенно особенной, восстановительной среде, где нет доступа кислороду и другим окислительным агентам привычной среды обитания. Поэтому, видимо археи используют совершенно иной механизм синтеза и удаления лейцина (а может, его там вообще нет??). Исследование и поиск метаболитических реакций в археях ещё в самом начале и привлекает собой исследователей, так как многое неизвестно и необычно в этих организмах.