На главную страницу четвертого семестра.

Классификация функций. Коды ферментов. Дополнительные упражнения.

Задание № 1. Характеристика фермента 4.2.3.12.

Согласно записям БД BRENDA, относящимся к синтазам EC 4.2.3.12, была составлена следующая характеристика исследуемого фермента. Схема катализируемой реакции приведена на рисунке ниже.

В БД BRENDA описано 68 последовательностей ферментов с EC 4.2.3.12. Данный фермент присутствует в клетке в виде самых различных четвертичных структур: мономеров, димеров, тримеров, пентамеров и даже гексамеров (поле Subunit). Возможно, это связано с необходимостью увеличения скорости обрабатывания субстрата с целью более быстрого получения продукта и в больших количествах. С другой стороны, возможно, что некоторые субъединицы являются регуляторными, отчего можно предполагать существенную роль фермента, как ключевой переключатель: в зависимости от функциональной активности, определяется состояние всего метаболитического пути. Посттрансляционные модификации синтаз довольно многочисленны: для фермента выделенного из печени Homo sapiens известно гликозилирование; для фермента, выделенного из определенного вида крыс (Rattus norvegicus) обнаружено отсутствие четырех N-концевых аминокислотных остатков; а фермент из организма Salmo salar вообще не содержит остатков сахаров (поле Posttranslational Modification). Болезни, связанные с синтазами EC 4.2.3.12, неизвестны (поле Disease). Данный фермент играет одну из ключевых ролей в биосинтезе тетрагидробиоптерина - кофермента, входящего в основном в состав диоксигеназ и других оксигеназ: с помошью него происходит окисление (хотя чаще наблюдается гидроксилирование - введение -OH групп в функциональные групп субстрата) субстратов за счет непосредственного участия молекул кислорода. Причем основной процесс, в котором задействован кофермент - катаболизм ароматических аминокислот, таких как фенилаланин, тирозин, причем интересно отметить, что так окисление фенилаланина в ароматическом кольце приводит к синтезу тирозина. То есть, можно утверждать, что роль синтезируемого с помощью синтетаз EC 4.2.3.12 кофермента тетрагидробиоптерина очень велика: синтез и катаболизм ароматическиз аминокислот, опосредование оксигеназной активности других ферментов. Поэтому, не исключено, что в поле Disease отсутствуют описания возможных болезней только по тому, что эмбрионы (а может и даже яйцеклетка), мутантные по этому гену, не доживают до постнатального этапа развития, а погибают на пренатальном этапе. Фактически, можно ожидать, что мутации по этому гену являются в основном леталями.
Все наблюдаемые характеристики суммированы в таблице:

Характеристика фермента 4.2.3.12 по данным БД Brenda
Количество ферментов с кодом 4.2.3.12, описанных в БД Brenda	68 ферментов.
Субъединичная структура, характерная для ферментов 4.2.3.12	мономер, димер, тример, тетрамер, пентамер, гексамер.
Пострансляционные модификации у ферментов 4.2.3.12	гликозилирование (человеческий фермент, выделенный из печени), отщепление аминокислот с N-конца (крысиный фермент), отсутствие гликозилирования.
Болезни человека, связанные с патологией фермента 4.2.3.12	не известны.

Задание №2. Сравнение аннотаций функций найденных трех ферментов в БД GOA с аннотациями в UniProt.

Поиск аннотаций в БД UniProt производился при помощи следующего запроса: ([uniprot-ECNumber:4.2.3.12] & (([uniprot-ID:*_Ecoli*] | [uniprot-ID:*_Human*]) | [uniprot-ID:*_Metja*])). При этом исследовалось наличие записей GO для ферментов, имеющих название гена или/и локуса. В итоге обнаружено три фермента-синтазы в трех далеких организмах: E.coli, H.sapiens, M.jannaschii. Из них только в записи второго белка - эукариотического - имелись идентификаторы GO, которые и были исследованы. Итак, по данным записи UniProt PTPS_HUMAN, фермент имеет шесть идентификаторов GO: один относится к онтологии клеточного компонента, два - онтологии молекулярной функции, и три - онтологии биологического процесса. Термин GO:0005739 описывает органеллу: митохондрион, где работает исследуемый фермент. Имеет сильное экспериментальное подтверждение: IDA, то есть свойство получено проведением прямого эксперимента. Итак, клеточная локализация фермента четко идентифицирована. Термины GO:0003874, GO:0042802 описывают молекулярную функцию (катализируемую реакцию) и взаимодействия белка с определенными макромолекулами соответственно. GO:0003874 является идентификатором реакции, катализируемой ферментом: вторая стадия биосинтеза тетрагидробиоптерина; 6-пирувилтетрагидроптерин синтазная активность: катализ биохимической реакции, приведенной выше на рисунке. GO:0042802 описывает тот факт, что белок может селективно взаимодействовать с идентичным белком (или белками). То есть фактически, термин GO описывает возможное наличие четвертичной структуры у фермента 4.2.3.12, которое также подтверждено в БД Brenda (см. выше), где к тому же приведены ссылки на соответствующие статьи, в которых производилось исследование ферментов с различной четвертичной структурой. Оба термина, описывающих молекулярную функцию белка, также имеют довольно весомые экспериментальные подтверждения: TAS и IPI соответственно. То есть, катализируемая метаболитическая реакция является общеизвестным фактом из давно проведенных биохимических исследований, а наличие четвертичной структуры подтверждено экспериментами по непосредственному изучению взаимодействия молекул белка друг с другом. Термины GO:0006520, GO:0007417 и GO:0006729 описывают биологический процесс, в который вовлечен фермент PTPS_HUMAN: метаболизм аминокислот, развитие центральной нервной системы (ЦНС) и биосинтез тетрагидробиоптерина соответственно. На счет первого и третьего терминов, уже многое обсуждалось выше. Действительно, биосинтез тетрагидробиоптерина - непосредственный процесс, в котором задействован исследуемый фермент. Но получаемый продукт является важным кофактором для оксигеназ, конвертирующих аминокислоту фенилаланин в тирозин, то есть функциональное состояние фермента 4.2.3.12 косвенным образом влияет на синтез/катаболизм ароматических кислот: недостаток, или повреждающие мутации, приводящие к выпадению фермента из цепочки синтеза кофермента может привести к неспособности производить тирозин и утилизировать фенилаланин клеткой. Вообще, такой факт может служить интересной предпосылкой для выяснения роли этого белка в развитии фенилкетонурии - генетически-обусловленной болезни, приводящей к неспособности организмом утилизировать фенилаланин. Но учитывая, что в БД Brenda не было указаний на роль фермента в патогенезе различных болезней, то может быть, таких связей между активностью PTPS_HUMAN и развитием фенилкетонурией пока обнаружено не было. Хотя в этом несколько приходится сомневаться, так как второй термин GO:0007417 описывает развитие ЦНС, а как известно, развитие фенилкетонурии на ранних стадиях развития организма (в детском возрасте), если не производить профилактику болезни вовремя, приводит к умственной отсталости. То есть, судя по этим терминам GO, приводимым в запиcи UniProt, можно все таки предполагать наличие корреляций между патологическим состоянием и активностью синтазы.
По данным БД GOA, терминов GO для эукариотического белка PTPS_HUMAN содержится больше, причем также имеющим как экспериментальное, так и компьтерное подтверждение. Дополонительные термины GO следующие: GO:0006520, GO:0006729, GO:0007417, относятся к онтологии биологического процесса и имеют экспериментальное подтверждение TAS, получены из записей БД Proteome Inc: аналогично терминам записи UniProt, описывают роль фермента в метаболизме аминокислот, развитии ЦНС и биосинтезе тетрагидробиоптерина; GO:0003874, GO:0042802 - относятся к онтологии молекулярной функции и имеют экспериментальные TAS и IPI подтверждения соответственно, первый термин получен из БД Proteome Inc, второй - из БД IntAct: эти термины также описывают катализируемую ферментом реакцию (GO:0003874) и способность белка образовывать сложную четвертичную структуру за счет объединения одинаковых молекул в единый комплекс (GO:0042802); GO:0005737, GO:0005739, относятся к онтологии клеточного компонента и имеют сильное экспериментальное подтверждение IDA (прямой эксперимент), получены из БД LIFEdb: термины описывают локализацию фермента в цитоплазме (первый термин), но так как первый термин связан косвенно (через термин "Cellular component") типом связи part of a, то второй термин (описание локализации в митохондрионе) является частным случаем первого. Итак, видно, что большее количество терминов GO для фермента 4.2.3.12 в БД GOA является следствием того, что дополнительные термины получены из других баз данных. Также термины GO были найдены и для бактериального (PTPS_ECOLi) и архейного (PTPS_METJA) белков, причем все термины одинаковы и имеют только компьютерное доказательство IEA. Причем имеются термины, относящиеся только к двум онтологиям: биологический процесс (один термин: GO:0006729, описывает процесс биосинтеза тетрагидробиоптерина, получен из БД InterPro) и молекулярная функция (четыре термина: GO:0003874, GO:0008270, GO:0016829, GO:0046872, описывают 6-пирувилтетрагидроптерин синтазную активность, способность связывать ионы цинка, синтазную активность и способность связывать ионы металла соответственно). А на клеточную локализацию фермента нет ни одного указания, что видимо связано с тем, что подтвердить клеточное расположение компьютерными методами практически невозможно, а экспериментов по исслеованию ферментов в составе этих организмов проведено не было.
Итак, причин, почему аннотированых функций в БД UniProt меньше, чем в БД GOA может быть несколько:
1) аннотирование записей в UniProt отстает от аннотирования записей в GOA (GOA является специализированной БД, содержащей только аннотации, БД UniProt в первую очередь предназначена для хранения аминокислотных последовательностей)
2) все термины GO для ферментов 4.2.3.12 из бактерии и археи идентичны и имеют полностью компьтерное подтверждение, что видимо кураторами БД UniProt считается недостаточным для предписания определенных функций белку.

Задание №3. Сравнение cвойств ферментов 4.2.3.12 из Homo sapiens и Escherichia coli с помощью БД Brenda.

На странице БД Brenda был проведен поиск данных относящихся к ферменту 4.2.3.12 с помощью этого номера ЕС. В результате собраны следующие характеристики синтаз из Homo sapiens и Escherichia coli:

рН оптимум обоих ферментов находится в слабощелочной среде: для фермента из H. sapiens это интервал 7.5 - 8, а для фермента из Escherichia coli - интервал 6.5 - 7. В принципе, наблюдаемые величины могут косвенно указывать на клеточную локализацию ферментов. Действительно, как известно матрикс митохондрий эукариотической клетки имеет слабо щелочную реакцию из-за потока протонов по градиенту электрохимического потенциала, направленного через митохондриальную мембрану, во врему работы цепи переноса электронов. Градиент электрохимического потенциала как раз направлен в сторону цитоплазмы. Если сравнить записи GO для эукариотического фермента, то можно отметить, что в онтологии Component есть термин, относящийся к описанию митохондриона клетки. Так что значение рН оптимума точно способствует отнесению фермента к субпопуляции ферментов "энергетических станций" клетки. Что касается прокариотического фермента, то в этом случае косвенное указание на локализацию сделать сложнее: в бактериальных клетках нет митохондрий. Но у них цепь переноса электронов встроена в плазматическую мембрану, поэтому можно ожидать, что синтаза бактерий 4.2.3.12 является цитоплазматическим ферментом (но ссылки на GO термины отсутствуют).
Оба фермента являются хорошо изученными белками, так как имеют довольно много описанных ингибиторов и активаторов. Для эукариотического фермента ими являются следующие соединения: 4-винилпиридин, вызывающий 95% инактивацию без денатурации и повреждения фермента; ЭДТА - вызывает полную инактивацию засчет связывания Mg²⁺ в активном центре фермента. Для прокариотической синтазы изучено ингибиторное действие следующих веществ: ЭДТА при концентрациях выше 10 мМ; ионы тяжелых и щелочноземельных металлов: Сa²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Ni²⁺ - все эти ионы при концентрации 10 мМ обеспечивают 40-100% инактивирование фермента.
Активирующими агентами для исследуемых ферментов являются: дитиоэритриол - увеличивает каталитическую активность эукариотического фермента при концентрации 10 мМ; ЭДТА - увеличивает каталитическую активность до 110-120% бактериального фермента при концентрации 1-5 мМ.