Занятие 7. А-и В-формы ДНК.

Задание №1.

С помощью программы fiber пакета 3DNA были построены две формы ДНК: А и В. В качестве последовательности смысловой цепочки ДНК предложено использовать олигонуклеотид GATC, повторенный четыре раза. Структура дуплекса в А-форме сохранена в файле gatc-a.pdb, а структура дуплекса в В-форме сохранена в файле gatc-b.pdb. Для этого, в командной строке UNIX вводилась следующая команда:

fiber -a(или b в зависимости от желаемой структуры ДНК)

и далее заносились необходимые данные на запрос данной программы (это и последовательность нуклеотидов в одной из цепочек ДНК, сколько раз повторенная и имя выходного файла).

Задание №2.

Используя полученные файлы и производя определенные расчеты, заполнена следующая таблица

	A-форма	B-форма	Файл dnaN.pdb
Тип спирали (правая или левая). Определение типа спирали производилось по следующей методике: молекулы рассматривались с торца и затем определялись способы закручивания цепочек ДНК: влево или вправо (причем сама цепочка ДНК "движется" от наблюдателя).	правая	правая	правая
Шаг спирали. Определение шага ДНК в файлах gatc-a.pdb и gatc-b.pdb производилось по алгоритму, предложенному в подсказках: изображалась одна цепочка ДНК, в шариковой модели изображались атомы фосфора. Смотря на модель "с торца", измерялось расстояние между "совпавшими" атомами фосфора. В случае ДНК из файла dna40.pdb было немного сложнее: в файле изображена модель ДНК, содержащей примерно 90% витка. Поэтому пришлось экстраполировать дальнейший поворот цепочки ДНК. Но для определения шага я поступил несколько иначе: измерил расстояние между соответствуюшими атомами фосфора, обрамляющими малую и большую бороздки (очевидно, что это были разные пары атомов, так как всего 90% витка). Затем эти две величины просуммировал и занес в таблицу.	28,03	33,74	33,58
Число оснований на виток. Определив атомы фосфора, обрамляющие виток, подсчитал число пар нуклеотидов, заключенных между ними. Причем, полагая, что атом фосфора относится к 5'-концу нуклеотида, получается, что "соответственный" атом фосфора является как раз началом второго витка. И у ДНК из файла dna40.pdb пришлось продлить виток до конца. Для этого пришлось "прибавить" одну пару комплементарных нуклеотидов, чтобы завершить виток, или две пары комплементарных нуклуотидов, чтобы получился целый виток и начало второго - так как тогда атом фосфора как раз соответствует атому фосфора начала первого витка.	11	10	10
Ширина большой бороздки (A).	При определении бороздок, учитывался тот факт, что большая бороздка обязательно глубже, чем малая, но не обязательно самая широкая. Измерение проводилось от фосфата цитидилового остатка с аббревиатурой С 24 chain B, или номером Р474. В результате получилось число 7,98	Измерение проводилось от фосфата аденилового остатка с аббревиатурой А 6 chain А или номером Р105. В результате получилось число 17,22	Измерение проводилось от фосфата цитидилового остатка с аббревиатурой Р, В 46 С 2. В результате получилось число 16,36
Ширина малой бороздки (A).	Измерение проводилось от фосфата цитидилового остатка с аббревиатурой С 24 chain B, или номером Р474. В результате получилось число 16,81	Измерение проводилось от фосфата аденилового остатка с аббревиатурой А 6 chain А или номером Р105. В результате получилось число 11,69	Измерение проводилось от фосфата тимидинового остатка с аббревиатурой P, В 261 Т 7. В результате получилось число 11,30

Анализируя полученные результаты, представленные выше в таблице, можно сделать некоторые выводы:

Во-первых, сумма ширины малой и ширины большой бороздок не равна шагу спирали, а несколько меньше для обеих форм ДНК. На мой взгляд, это связано с принятым способом измерения ширины бороздок (по принципу двух минимумов) и также способом измерения шага структуры. Для обеих форм шаг структуры вычисляется просто: расстояние между соответствующими атомами (например атомами фосфора), а ширина бороздок для разных форм определяется сложнее и величина фактически зависит от геометрии. Действительно, если вектор шага спирали в обоих случаях почти коллинеарен орте, тогда как вектора ширины малой и большой бороздок фактически являются перпендикулярами к комплементарным цепям ДНК, и определить их уже можно не только направлением, но и углом наклона цепей ДНК к горизонту. Тогда и получается, что чем "вытянутее", менее спирализованна молекула ДНК, тем ближе приближается модуль вектора суммы ширин бороздок к модулю вектора шага спирали, как у А и В-формы: причем сумма несколько меньше шага. Видимо связано это с тем, что ДНК отнюдь не прямая спираль, а в ней есть выступы, задаваемые векторами ширины малой и большой бороздок,а также и торсионные углы, участвующие в построении формы ДНК и особенностей хода спирали, влияют на соотношения между шагом спирали и шириной малой и большой бороздок.
Во-вторых, сравнивая результаты анализа модели ДНК из файла dna40.pdb с результатами заполнения первых двух столбцов, можно предположить, что данная экспериментальная модель - правозакрученная В-форма ДНК. Данному выводу способствуют все факты: и 10 нуклеотидов на виток, шаг спирали, ширина малой и большой бороздок близки к таковым для В-спирали. Как я писал выше (см. таблица), при анализе модели пришлось делать в некотором роде экстраполяции, из-за чего в принципе неизбежна ошибка, но в целом результаты хорошо коррелируют с данными для одной из "идеальных" форм ДНК (идеальных в том плане, что программа fiber строит теоретическую, "идеализованную" структуру ДНК). Также данному выводу способствует, наверное, наиболее сильное и броское отличие А-формы от В-формы: в А-форме, если смотреть с торца, есть центральная полость в 2-3 ангстрема, которая отсутствует у В-формы (из-за более сильной спирализованности и плотности).
В-третьих, наблюдение, не относящееся к анализу структурных взаимоотношений в структуре dna40: оказалось, что последовательность ДНК представляет палиндром: 5'- CCAACGTTGG - 3'. Вполне возможно, что данный палиндром является каким-нибудь сайтом рестрикции, так что узнается какой-нибудь системой рестрикции клетки (можно также отметить, что GATC - сайт рестрикции эндонуклеазами MboI&Sau3A и также палиндром, хотя очевидно, закономерности в выборе модельной последовательности ДНК нет, но все же можно произвести интересное наблюдение).

Задание №3.

С помощью следующих команд:

find_pair -t dna40.pdb stdout | analyze
find_pair -t gatc-a.pdb stdout | analyze

find_pair -t gatc-b.pdb stdout | analyze
Был произведен всесторонний анализ трех структур ДНК с помощью программы analyze. Для всех структур было получено довольно много различных файлов, в том числе dna40.out, gatc-a.out, gatc-b.out. В этих файлах была подчерпнута информация о главных торсионных углах молекул ДНК. Эти углы измерены для каждого нуклеотида в смысловой (STRAND I) и комплементарной (STRAND II) цепях.

Выдача программы для A-формы ДНК

  base    alpha    beta   gamma   delta  epsilon   zeta    chi
   1 G     ---    174.8    41.7    79.0  -147.8   -75.1  -157.2
   2 A    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.8   -75.1  -157.2
   3 T    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.8   -75.1  -157.2
   4 C    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.8   -75.1  -157.2
   5 G    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.8   -75.1  -157.2
   6 A    -51.7   174.8    41.7    79.0  -147.8   -75.1  -157.2
   7 T    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.8   -75.1  -157.2
   8 C    -51.7   174.8    41.7    79.0  -147.8   -75.0  -157.2
   9 G    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.8   -75.1  -157.2
  10 A    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.8   -75.1  -157.2
  11 T    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.8   -75.1  -157.2
  12 C    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.7   -75.1  -157.2
  13 G    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.8   -75.1  -157.2
  14 A    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.8   -75.1  -157.2
  15 T    -51.7   174.8    41.7    79.1  -147.8   -75.1  -157.2
  16 C    -51.7   174.8    41.7    79.1    ---     ---   -157.2

Выдача программы для B-формы ДНК

  base    alpha    beta   gamma   delta  epsilon   zeta    chi
   1 G     ---    136.4    31.1   143.4  -140.8  -160.5   -98.0
   2 A    -29.9   136.3    31.2   143.3  -140.8  -160.5   -98.0
   3 T    -29.9   136.3    31.1   143.3  -140.8  -160.5   -97.9
   4 C    -29.9   136.4    31.1   143.4  -140.8  -160.5   -98.0
   5 G    -29.9   136.3    31.2   143.3  -140.8  -160.5   -98.0
   6 A    -29.9   136.4    31.1   143.4  -140.8  -160.5   -98.0
   7 T    -29.9   136.3    31.2   143.3  -140.8  -160.5   -98.0
   8 C    -29.9   136.3    31.1   143.3  -140.8  -160.5   -97.9
   9 G    -29.9   136.4    31.1   143.4  -140.8  -160.5   -98.0
  10 A    -29.9   136.3    31.2   143.3  -140.8  -160.5   -98.0
  11 T    -29.9   136.4    31.1   143.4  -140.8  -160.5   -98.0
  12 C    -29.9   136.3    31.2   143.3  -140.8  -160.5   -98.0
  13 G    -29.9   136.3    31.1   143.3  -140.8  -160.5   -98.0
  14 A    -29.9   136.4    31.1   143.4  -140.8  -160.5   -98.0
  15 T    -29.9   136.3    31.2   143.3  -140.8  -160.5   -98.0
  16 C    -29.9   136.4    31.1   143.4    ---     ---    -98.0

Выдача программы для ДНК из файла dna40.pdb

  base    alpha    beta   gamma   delta  epsilon   zeta    chi
   1 C     ---     ---    170.0    98.1  -164.1   -77.2  -152.7
   2 C    -70.0   177.0    56.9   148.5   -99.9   165.2   -83.7
   3 A    -74.7   145.9    52.1   143.0   173.4   -87.1   -82.3
   4 A    -70.1   177.7    47.5   123.7   173.6   -96.9   -96.8
   5 C    -65.2  -179.7    49.2   144.8  -114.2  -179.1   -95.6
   6 G    -75.5   153.4    43.4   130.4   168.8   -88.7  -105.3
   7 T    -64.4   170.5    65.3   125.6  -163.6   -85.3  -129.6
   8 T    -81.9  -173.3    45.5   134.3  -100.3   167.3   -88.1
   9 G    -75.6   152.2    48.3   145.6  -172.8   -87.9   -76.3
  10 G    -69.4   159.1    52.6    96.2    ---     ---   -107.4

В качестве особенностей этих данных можно отметить следующее: в идеальных моделях структур А- и В-ДНК все семь торсионных углов одинаковы для каждого нуклеотидов; в случае модели природной молекулы ДНК из файла dna40.pdb значения углов для каждого из нуклеотидов довольно сильно варьируют. Поэтому решено было рассчитать среднее значение каждого угла на цепочку. Но по данным программы выяснено, что только для нуклеотидов с 3-8 точно предсказана конформация B-формы, поэтому среднее значение торсионного угла рассчитывалось для выше перечисленных нуклеотидов; также торсионные углы указаны для нуклеотидов в комплементарной последовательности, но так как все структуры ДНК (и gatc-a.pdb, gatc-b.pdb, dna40.pdb) палиндромны, то значения углов фактически являются зеркальным отражением значений углов в смысловой цепочке ДНК. Итак, информация о торсионных углах суммирована ниже в таблице:

	A-форма	B-форма	Файл dnaN.pdb
α-торсионный угол.	-51.7	-29.9	-72.0
β-торсионный угол.	174.8	136.4	с данным углом несколько сложнее: если все значения были больше нуля, то для двух нуклеотидов (5-ого и 8-ого) значения обратны по знаку. Посмотрев на случай с 5-ым нуклеотидом поближе на структуре, можно заметить, что на этом участке приведено исправленное положение нуклеотида и этот угол по связи СН₂(5)-O сильно различается для "исправленного" нуклеотида и находящегося в цепи. Очевидно, причиной такому сильному отклонению значения угла - ошибки расшифровывания рентгеноструктурной карты дифракции данной структуры. Возможно, что для исправленного нуклеотида значения угла более коррелируемы. Аналогичная ситуация и с 8-ым нуклеотидом. Отчего решено было привести среднее значение угла без этих нуклеотидов. Оно равно 162.0
γ-торсионный угол.	41.7	31.2	50.5 Для данного угла от среднего значения отклоняется лишь один угол для одного основания: 5'-концевой цитидин.
δ-торсионный угол.	79.1	143.4	133.6 В целом, значения углов для всех оснований колеблются около одного заначения, отчего просто установить среднее значение угла.
ε-торсионный угол.	-147.8	-140.8	22.95 От среднего значения сильно отклоняются углы концевых оснований, поэтому решено было в выражение для фориулы расчета среднего не включать эти два значения.
ζ-торсионный угол.	-75.1	-160.5	-76.7
χ-торсионный угол.	-157.2	-98	-99.6

Исходя из данных таблицы видно, что и значения торсионных углов (и особенно значение δ-угла, определяющего конформацию дезоксирибозы: либо С2'-эндо, либо С3'- эндо) удовлетворительно совпадают со значениями углов идеальной В-формы. Отчего вывод: структура из файла dna40.pdb - определенно В-форма ДНК.
Из всего потока информации, приведенной программой analize, мне показались очень интересными следующие данные (на примере анализа файла dna40.pdb):

в файле dna40.out: приведены данные о длинах водородных связей между комплементарными парами нуклеотидов, в этой же таблице данные о неканонических типах взаимодействий между нуклеотидами и др.; локальные параметры комплементарных пар: очень интересная информация о конформационных изменениях контактов пар нуклеотидов: по типу ножниц (или иначе сдвиг), кручение по типу пропеллер, растянутость связей, шатание (или качание) связей, прогиб плоскости контакта и также открытость (тлт наличие щели) данной пары нуклеотидов;

аналогичные данные приведены для локальных свойств шага между двумя последовательными парами нуклеотидов: то есть измерения сдвига, скольжения, наклонения, поднятия, раскатывания, поворота одной пары нуклеотидов относительно другой пары комплементарных нуклеотидов;

Также свойства спирали для каждой пары нуклеотидов; размеры малой и большой бороздок - важно знать этот параметр при анализе белок - ДНК взаимодействий (на мой взгляд), так как в основном такие взаимодействия происходят между α-спиралями белка и бороздками ДНК;
есть скрипт-файл col_chains.scr, красящий цепочки ДНК в красный (смысловая цепь) и зеленый (комплементарная цепь) цвета;
есть скрипт файл col_helices.scr, который окрашивает спирали ДНК в разные цвета (если их несколько).
приведены pdb-файлы, изображающие стэкинг между комплеметарными парами нуклетидов в молекуле ДНК.

Задание №4.

Пользуясь программой pdb2img, получены изображения структур днк из файлов dna40.pdb, gatc-a.pdb, gatc-b.pdb в виде стопочных моделей: вид сверху и вид сбоку. Для получения вида молекулы сбоку использовалась программа (на примере файла dna40.pdb: для остальных файлов все аналогично):

rotate_mol -b dna40.pdb dna40_bpmi.pdb

Затем полученный .pdb файл подавался на вход следующей программе:

pdb2img -bcm dna40_bpmi.pdb dna40_bpmi.ps

Полученное изображение затем конвертировалось в картинку.
Для получения вида с торца, действия были намного проще, но только для моделей из файлов gatc-a.pdb, gatc-b.pdb: достаточно было использовать команду pdb2img и исходные файлы gatc-a.pdb или gatc-b.pdb:

pdb2img -bcu gatc-a.pdb gatc-a.ps

Чтобы получить вид с торца для молекулы ДНК из файла dna40.pdb, сперва создавался файл MY.scr, который кодирует новую ориентацию молекулы ДНК "вид с торца", созданной с помощью Rasmol'a. Затем в строке Unix вводились следующие команды:

rotate_mol -r=MY.SCR dna40.pdb dna40x.pdb

pdb2img -bcu dna40x.pdb 40x.ps

В результате чего получалось необходимое изображение.
Картинки приведены ниже:

модель молекулы днк из файла dna40.pdb

вид сбоку	вид с торца

модель молекулы днк из файла gatc-a.pdb

вид сбоку	вид с торца

модель молекулы днк из файла gatc-b.pdb

вид сбоку	вид с торца

На изображении "с торца" видимо бледным цветом показан остов одной цепи ДНК, а более ярким - остов другой цепи ДНК.
Как видно из привиденных стопочных структур, можно отметить несколько задач, которые можно решить с помощью стопочных структур. Итак:

Во-первых, довольно легко можно установить тип спирали: право- или левовращающая. Это проглядывается по тому, как заворачивается более яркая или более бледная цепочка: против, или по часовой стрелки.
Во-вторых, можно измерить или хотя бы прикинуть длину спирали. Во всяком случае, по виду сбоку очень хорошо детерминируются А- и В-формы ДНК: действительно, так как диаметр А-формы ДНК несколько больше диаметра В-формы (все же в центре А-формы наблюдается пора) и из-за С3'-эндо конформации рибофосфатного остова, что приводит к большему "растаскиванию" цепочек спирали друг от друга, то в целом, спираль словно "прижимается" к основанию, как будто её нечто сжимает сверху, поэтому она более закрученная и главное, нормаль каждой пары комплементарных оснований не параллельна общей оси спирали. Однако, в В-форме видна "более прямая" спираль, нормаль каждой пары комплементарных фактически параллельна общей оси спирали, отчего при измерении одного витка спирали, длина В-формы несколько больше длины спирали А-формы.
В-третьих, с помощью таких структур очень легко и просто можно проиллюстрировать и проанализировать любую нуклеиновую спираль на наличие необычных конформационных изменениях в комплементарных парах оснований. Например, о тех, которые приведены в пункте об интересных данных, выдаваемых программой analize.