Поиск гомологов некодирующей нуклеотидной последовательности.

[На главную][Третий семестр]

I.Необходимо было определить, какая тРНК была (скорее всего) использована рибосомой при присоединении 4-ого аминокислотного остатка к растущей цепи вашего белка.

 

 

Для этого:

*  Узнали, какой аминокислотный остаток находится в 4-ой позиции белка AZOR_ECOLI – это: Лейцин  (L   Leu   Leucine). Данные из  аминокислотной последовательности AZOR_ECOLI.   

*  Определили соответствующий ему кодон в гене белка AZOR_ECOLI,  и записали его используя 'U' и правило 5'→3' (5'-TTA-3'). Данные из  нуклеотидной последовательности AZOR_ECOLI.   

*  Справляясь с таблицей стандартного генетического кода определили возможную вырожденную позицию в данном кодоне (1 и 3) . Выделили ее подчеркиванием.

*  Записали последовательность "идеального" (т.е. полностью комплементарного) антикодона, используя 'U' и правило 5'→3'. (5'-UAA-3') Подчеркнули вырожденную позицию.

 

Команды, использованные при выполнении данного упражнения:

*  grep codon.*leucine ecoli.embl > codon_l.txt   
При этом программа находит не только лейцин, но и изолейцин.

*   seqret -sask ecoli.embl
(в качестве параметров указывались координаты и имя выходного файла). В результате получен файл с последовательностью tRNA5.

В результатах поиска всех лейциновых тРНК у Escherichia coli K-12 приведены не все строки, а только те, что описывают  лейцин (нет записей для изолейцина). Для дальнейшего изучения была выбрана пятая тРНК: tRNK5.

Аминокислотный остаток в 4-ой позиции белка AZOR_ECOLI

L

Соответствующий кодон в гене acpD

5'-TTA-3' (вырожденная позиция – последний нуклеотид - A, т.к и TTG кодирует лейцин. Кроме того, первый нуклеотид Т можно также считать условно вырожденным, т.к. кодон СTA также кодирует лейцин, вместе с кодонами СTT, СTC, СTG.

Идеальный антикодон

5'-UAA-3'

Сколько можно было бы ожидать разных тРНК для остатка L
(если опираться на генетический код)?

Можно было ожидать 6 вариантов тРНК, т.к. в генетическом коде используется 6 вариантов для кодирования лейцина: TTA, TTG, CTT, CTC, CTA и CTG.

Сколько тРНК для остатка L аннотировано в геноме кишечной палочки?

В геноме E.coli аннотировано 5 разных тРНК, причем для тРНК1 приведено 4 разных гена.

Характеристика выбранной для дальнейшего изучения лейциновой tRNA5:

название гена

leuX

координаты гена в записи EMBL

4494428..4494512

антикодон

CAA

Результат поиска всех лейциновых тРНК у Escherichia coli K-12:

 
      FT                   /note="codons recognized: CUR; anticodon: UAG leucine
      FT                   /note="codons recognized: UUR; anticodon: UAA leucine
      FT                   /note="codons recognized: CUY; anticodon: GAG leucine
FT                   /note="codon recognized: CUG; anticodon: CAG leucine tRNA1;
      FT                   /note="codons recognized: UUR; anticodon: CAA leucine
FT                   /note="codon recognized: CUG; anticodon: CAG leucine tRNA1;
FT                   /note="codon recognized: CUG; anticodon: CAG leucine tRNA1;

FT                   /note="codon recognized: CUG; anticodon: CAG leucine tRNA1;

 

 

II. Поиск гомологичных тРНК в геноме архебактерии

Задача — найти в геноме архебактерии последовательность, наиболее похожую на отобранную в упр1. tRNA5 из E.coli, чей антикодон отличается от «идеального» только в вырожденной позиции, зато ген находиться на прямой цепи и его нуклеотидная последовательность больше. Поиск проводился в геноме Pyrococcus furiosus.

Поиск был проведен с помощью 4-х разных программ, предназначенных для быстрого поиска сходных нуклеотидных последовательностей.

Результаты в таблице:

 

Программа

FastA

BLASTN

MegaBLAST

Discontigous
MegaBLAST

Число находок с Е-value < 0,001

0

0

0

0

Характеристика лучшей находки:

E-value находки

0.77

1.7

-

-

Номер сектора генома

130

96

-

-

AC соответствующей записи EMBL

AE010255

AE010221

-

-

координаты выравнивания(-ий) в записи EMBL

5427-5466

4102-4114

-

-

Аннотация лучшей находки по EMBL

tRNA Leu антикодон TAA

Неаннотированный гипотетический белок.

-

-

*  Команды, использованные при выполнении данного упражнения:
1.) formatdb -i pf_genome.fasta -n pf -p F
Результат: три индексных файла (pf.nhr, pf.nsq, pf.nin) генома Pyrococcus furiosus .
2.) blastall -p blastn -d pf -i leux.fasta -o result_blastnx.txt
Результат: файл с  находками и  выравниваниями, созданными программой BLASTN. Все значения e-value значительно больше 0.001.
3.) fasta35 leux.fasta pf_genome.fasta 6
Была задана длина якоря  (6) и в командной строке были указаны входные файлы, так же то, сколько находок показать, показать ли ещё, отображать ли выравнивания и сколько.
4.) megablast -d pf -i leux.fasta -D 2 -o result_mega.txt
Результат: Ничего не было найдено.
5.) megablast -d pf -i leux.fasta -D 2 -N 1 -W 11 -t 21 -o result_dismega.txt   (Для запуска команды необходимо задать опцию -t. Для начала была задана длина паттерна 21 вида ( 1101101101101101), затем 16 -  чтобы  получить хотя бы низко достоверные находки. Якорь (-W) был задан равным 11. Тип паттерна (-N) - некодирующий (1) Результат: программа не выдает результатов при использовании  любых различных комбинации -N, -w , –t  и -e.)

Как видно из таблицы, наиболее эффективной оказалась программа FastA , ее находка с самым низким Е-value действительно оказалась лейциновой тРНК. FastA для проведения локального выравнивания использует весьма чувствительный алгоритм Смита-Ватермана. Который, благодаря небольшой длине якоря (6 bp ), позволяет зацепить даже отдаленные возможные  гомологи гена.

В то же время, программы BLASTN, MegaBLAST и Discontigous
MegaBLAST не дали вразумительных результатов. Это можно объяснить тем, что данные программы в большей степени предназначены для быстрого поиска близкородственных последовательностей. Длина якоря в MegaBLAST по умолчанию равна 28, что дает этой программе преимущество в скорости над BLASTN, чей якорь11, но зато снижает ее чувствительность, позволяя ей находить только очень родственные или идентичные последовательности.

Спивак Ольга