База данных KEGG. Исследование метаболического пути деградации изолейцина до ацетилкофермента А.

Графические формулы и идентификаторы изолейцина и ацетилкоэнзима A в KEGG.
Будем считать, что мы работаем с метаболизмом белков, поэтому нас интересуют L-аминокислоты, в частности, L-изолейцин. Наша задача – определить, существует ли метаболический путь деградации L-изолейцина до ацетилкофермента A (ацетил-КоА). Найдем графические формулы и идентификаторы двух названных низкомолекулярных соединений в БД KEGG, для чего обратимся к суб-БД химических соединений и реакций (ссылка "LIGAND" на главной странице KEGG) и проведем поиск поочередно по названию каждого вещества. В списке, выдаваемом как результат поиска, рассматривались записи KEGG с идентификатором "cpd" – compound (компонент). Для изолейцина была выбрана запись с идентификатором "C00407", соответствующая его L-форме. Графическая формула выглядит так:

L-изолейцин (L-Isoleucine, 2-Amino-3-methylvaleric acid)
Для ацетилкоэнзима А поиск велся по распространенной аббревиатуре CoA; была выбрана запись c идентификатором "C00024"

Ацетилкоэнзим А (Acetyl coenzyme A, Acetyl-Coa)
Поиск метаболического пути.
KEGG позволяет не только рассматривать метаболические карты, но и окрашивать их элементы в нужные цвета. Для этого существует программа, ссылка на которую дается в таблице-оглавлении ("Table of contents") базы данных. Для задания этой программе объектов карты и цветов, в которые их нужно окрасить, необходимые данные вводятся в специальное поле. Мы использовали такую последовательность "команд", первые две из которых относятся к исследуемым веществам, а остальные – к ферментам*, катализирующим реакции метаболического пути деградации изолейцина до ацетил-КоA:
```
cpd:C00407 red
cpd:C00024 red
2.6.1.42 yellow
1.2.1.25 yellow
1.3.99.2 yellow
1.3.99.12 yellow
4.2.1.17 yellow
1.1.1.35 yellow
1.1.1.178 yellow
2.3.1.16 yellow
```
В результате получили список метаболических карт, в которых участвуют указанные вещества и ферменты*. Из них выбрали первую – под названием "Деградация валина, лейцина и изолейцина". Ниже приведен фрагмент этой карты, на котором схематично изображена цепочка ферментативных реакций, приводящих к деградации L-изолейцина до ацетилкоэнзима A (названные вещества отмечены красным). Изображение не совсем соответствует фрагменту карты KEGG (многие не относящиеся к нашей реакции элементы убраны, некоторые стрелки для удобства укорочены).

Деградация L-изолейцина до ацетилкофермента A.

Желтым на карте покрашены ферменты*, катализирующие те или иные реакции, относящиеся к нашему метаболическому пути. Как видим, большинство из них являются оксидоредуктазами, отметим также, что некоторые реакции могут быть катализированы сразу двумя ферментами. Первая реакция (превращение L-изолейцина в 3-метил-2-оксопентаноат) может идти двумя путями – обратимым и необратимым – каждый из которых катализируется своим ферментом. Интересно, что эти ферменты относятся к разным классам (обратимую реакцию катализирует оксидоредуктаза, а необратимую – трансфераза). Для нашего метаболического пути в качестве первого этапа мы выбрали необратимую реакцию.

* Под "ферментом" здесь подразумевается не конкретный белок, а скорее функциональная активность!

Исследование выбранного метаболического пути.

Как выяснилось, метаболический путь деградации L-изолейцина до ацетил-КоA существует, и он описан в KEGG. Наикратчайший такой путь включает шесть стадий, которые катализируются в общем счете восемью ферментами. Ниже приведена таблица, в которой описаны первые три стадии деградации изолейцина. Данные получены с использованием записей KEGG о химических реакциях; к нужным записям переходили с метаболической карты в режиме "Reference pathway (Reaction)", щелкая по прямоугольникам с указанием кода фермента, катализирующего интересующую нас реакцию.

Таблица1: Первые три стадии возможного пути превращения L-изолейцина в ацетилкоэнзим A.

Этап Ферментативная реакция Фермент

1 L-Isoleucine + 2-Oxoglutarate <=> 3-Methyl-2-oxopentanoate + L-Glutamate EC 2.6.1.42

2 3-Methyl-2-oxopentanoate + CoA + NAD+ <=> 2-Methylbutanoyl-CoA + CO2 + NADH EC 1.2.1.25

3 2-Methylbutanoyl-CoA + Oxygen <=> 2-Methylbut-2-enoyl-CoA + 2 H2O
2-Methylbutanoyl-CoA + FAD <=> 2-Methylbut-2-enoyl-CoA + FADH2
EC 1.3.99.2
EC 1.3.99.12, EC 1.3.99.3

Заметим, что один из продуктов предыдущего этапа всегда участвует в следующем, то есть реакции образуют цепочку. Особо интересным показался третий этап деградации изолейцина. На карте указано, что реакцию превращения 2-метилбутаноил-КоA в 2-метилбут-2-еноил-КоA могут катализировать два фермента. После перехода к записи KEGG, соответствующей этой реакции, замечаем, что реакции, катализируемые этими ферментами, на самом деле не идентичны. В одном из случае указанное превращение требует наличия кислорода (как акцептора электронов в окислительно-восстановительной реакции), в другом реакция протекает и в анаэробных условиях, но необходим кофермент FAD. Еще более интересно, что вторая реакция (FAD-зависимая) может, в свою очередь, катализироваться не только тем ферментом, что указан на карте (EC 1.3.99.12), но и еще одним (EC 1.3.99.3), который на метаболической карте не указан. Мы проверили, что под этими кодами имеются в виду разные ферменты (в IUBMB Enzyme Nomenclature для 1.3.99.12 указано "Not identical with EC 1.3.99.3"). Значит, третий этап деградации изолейцина может катализироваться не двумя, а тремя ферментами, при этом один из них не упоминается на метаболической карте, описывающей соответствующий путь.

Таблица 2: Деградация L-изолейцина до ацетил-КоA у различных организмов.

Организм

Возможно ли превращение изолейцина в ацетил-КоA по данным KEGG?

Краткое обоснование

Homo sapiens Нет Неизвестен ген фермента, катализирующего вторую стадию (ЕС 1.2.1.25)
Однако более длинная (на один этап на уровне второй стадии, см. изображение метаболического пути выше) цепочка вполне осуществима, то есть в принципе деградация изолейцина до A-CoA в человеческом организме возможна

Escherichia coli K-12 MG1655 Нет Неизвестны гены ферментов, катализирующих вторую (ЕС 1.2.1.25) и третью (EC 1.3.99.2, EC 1.3.99.12) стадии.
Даже более длинный путь превращения (см. выше) невозможен (неизвестен ген фермента 1.2.4.4)

Pseudomonas aeruginosa PAO1 Нет Неизвестен ген фермента, катализирующего вторую стадию (ЕС 1.2.1.25)
Даже более длинный путь превращения (см. выше) невозможен (неизвестен ген фермента 2.3.1.-)

Methanococcus maripaludis* Нет Неизвестны гены ферментов, катализирующих все реакции пути, кроме первой и последней

*В задании было указано исследовать метаболическую карту для Methanococcus janaschii, но такой вид в KEGG не описан, из рода Methanococcus есть только вид M.maripaludis (см. здесь).

Как видно из таблицы, у человека, кишечной палочки, псевдомонады и метанококка деградация изолейцина до ацетил-КоA по изучаемому (наиболее короткому) пути по данным KEGG невозможна. Это означает, что указанные желтым на схеме ферментативные активности у этих организмов "не привязаны" к определенным белкам. То есть, либо вообще не существует ферментов, катализирующих ту или иную реакцию (то есть организм не способен превращать изолейцин в ацетил-коA по прямому пути), либо такие белки есть, но они еще не аннотированы должным образом. Только у самого изученного организма из четырех названных – человека – может осуществляться более длинный путь (с одной дополнительной стадией, точней, с заменой одной стадии двумя) деградации, у остальных деградация изолейцина до ацетил-KoA не представляется возможной на данном уровне исследования метаболических путей и ферментов.

Во всех четырех случаях неизвестен фермент, катализирующий вторую стадию деградации (ЕС 1.2.1.25). Рассмотрев запись KEGG о этом ферменте, узнали, что нет ссылок на другие БД (ни на Brenda, ни на какую-либо еще базау данных) а также вообще нет информации о генах, кодирующих белок с такой ферментативной активностью ни для одного организма. Поэтому можно ожидать, что какой бы мы организм из описанных в KEGG ни выбрали, деградация изолейцина до ацетил-KoA по изучаемому пути у него будет невозможна.