Занятие 9. Мембранные белки, транспортные белки.
1. Построение выравнивания заданного белка и белка-прототипа с разметкой трансмембранных сегментов
1. Сравнение нумерации остатков белка-прототипа FIEF_ECOLI в UniProt и PDB
Из БД PDBsum получим выравнивание последовательности из PDB с идентификатором 3H90 и соответствующей последовательности UniProt. Для этого нужно щелкнуть изображение выравнивания последовательности в структуре, скопировать полученное выравнивание, сохранить его в fasta-формате и импортировать в GeneDoc:
Нумерцаия аминоксилотных остатков в UniProt и PDB совпадает, но в PDB представлен лишь фрагмент последовательности из UniProt с 8 по 290 а.о., т.е. обрезанный как с С, так и с N-конца.
Файл с выравниванием в формате msf: algn1.msf.
2. Построение полного глобального выравнивания заданного белка FIEF_ERWCT и белка-прототипа FIEF_ECOLI
С помощью seqret получим последовательности белков FIEF_ERWCT и FIEF_ECOLI в fasta-формате: fief_erwct.fasta, fief_ecoli.fasta. Затем выровняем их при помощи программы needle пакета EMBOSS, при этом штрафы за гэпы оставим стандартные (10.0 за открытие гэпа, 5.0 за его продление). Получили выравнивание algn2.needle. Импортируем его в GeneDoc для выполнения следующих заданий: algn2.msf.Выравнивание характеризуется малым числом гэпов (2/301), процент идентичности составляет 69,8% (210/301).
3. Создание разметки трансмембранных сегментов в белке-прототипе FIEF_ECOLI по данным БД ОРМ
В БД ОРМ по PDB ID найдем описание ТМ-сегментов в белке-прототипе (PDB ID 3h90). Этот белок представляет собой насос, который осуществляет выведение двухвалентного железа из клетки (ferrous-iron efflux pump fieF). Описание этого белка на сайте БД ОРМ таково:Тип: 1. Трансмембранные белки (transmembrane)
Класс: 1.1. Альфа-спиральные трансмембранные белки (alpha-helical transmembrane)
Надсемейство: 1.1.43. Белки, осуществляющие перенос катионов (cation diffusion facilitator)
Семейство: 1.1.43.01. Бактериальные цинковые переносчики (bacterial zinc transporters)
На изображении, полученном в Jmol, представлены две субъединицы белка (идентичные цепи):
К полученному в упр.1.2 выравниванию algn2.msf добавим строчку с разметкой трансмембранных сегментов и сохраним в формате *.msf: mark.msf. В этом файле позиции мембранных сегментов отмечены буквой "H", цитоплазматических петель - "+", остальные (внеклеточные сегменты, а также С- и N-концы, отсутствующие в последовательности PDB) отмечены знаком "-".
Из выравнивания и изображения Jmol видно, что белок имеет довольно объемную (С-концевую) цитоплазматическую часть, N-конец также находится в цитоплазме. Мембранные сегменты представляют собой 6 альфа-спиралей, расположенных практически перпендикулярно поверхности мембраны. А вот надмембранных участков мало и они небольшого размера.
4. Предсказание топологии заданного белка FIEF_ERWCT с помощью TMHMM
С помощью сервера TMHMM получено предсказание топологии белка FIEF_ERWCT. Результаты этого предсказания также прикреплены к файлу mark.msf в виде искусственной последовательности "ТМНММ" с разметкой трансмембранных спиралей в соответствии с предсказанием.2. Сравнение полученного предсказания с данными ОРМ
Для сравнения результатов предсказания с данными ОРМ был написан скрипт Perl: count.pl. На вход программе подавались файлы с данными, полученными из OPM, и результатами предсказания TМНММ: opm.txt, tmhmm.txt.Поскольку последовательности FIEF_ERWCT и FIEF_ECOLI выровнялись без гэпов практически до конца (все мембранные участки, как предсказанные, так и по данным ОРМ, входят в этот промежуток), можно не менять координаты последовательностей для подсчета.
По результатам работы скрипта составим таблицу:
Результаты предсказания топологии мембранного белка FIEF_ERWCT
| Число а.к. остатков | |
| Всего а.к. остатков | 300 |
| Остатки, предсказанные как локализованные в мембране (всего) | 129 |
| Правильно предсказали (true positives, TP) | 90 |
| Предсказали не то, что нужно (а.о. предсказаны как мембранные, а по данным ОРМ таковыми не являются, false positives, FP) | 39 |
| Правильно не предсказали ( не предсказаны, и по данным ОРМ не находятся в мембране, true negatives, TN) | 161 |
| Не предсказали то, что нужно (остатки по данным ОРМ находятся в мембране, false negatives, FN) | 10 |
| Чувствительность (sensitivity) = TP / (TP+FN) | 0,9 |
| Специфичность (specificity) = TN / (TN+FP) | 0,805 |
| Точность(precision) = TP /(TP+FP) | 0,698 |
| Сверхпредсказание = FP/ (FP+TP) | 0,302 |
| Недопредсказание = FN / (TN+FN) | 0,058 |
Чувствительность предсказания в данном случае оказалась довольно высокой (90%), то есть были предсказаны практически все мембранные остатки из существующих. Специфичность оказалась чуть ниже, но также на достаточном уровне (около 80%) - большая часть остатков, не погруженных в мембрану, тоже определилась правильно. Точность предсказания была еще ниже - среди остатков, предсказанных как мембранные, правильно угаданы были только ~70%.
Недопредсказание в данном случае оказалось совсем незначительным (5,8%), а сверхпредсказание довольно значительным (порядка 30%) - за счет этого не очень велика точность предсказания.
ТМНММ предсказала все 6 трансмембранных участков, причем 5 из них (первые четыре и последний по порядку их расположения в последовательности) предсказаны более-менее верно. ТМНММ в основном указывала более широкие границы для этих участков, но все действительно находящиеся в мембране остатки захватывала. Пятый участок (149-158) единственный оказался предсказанным неверно (158-175).
Назад