-назад-

Исследование белок-нуклеиновых контактов

1. Получила заданный файл PDB с сайта PDB — 1X9N.pdb.
   
   
2. Исследование контактов между молекулами белка и нуклеиновой кислоты
   
   
   • Посмотрела, как в тексте полученных структур названы нужные мне атомы:
     • атомы остатка сахара: углерод - DXj.Сi', i=1,2,3,4,5; кислород - DXj.Oi', i=4,5; где X=G,A,T,C; j=номер основания;
     • атомы остатка фосфорной кислоты: фосфор - DXj.P, кислород - DXj.OPi, i=1,2; где X=G,A,T,C; j=номер основания;
     • атомы азотистых оснований: углерод - DXj.Сi, i=2,3,4,5,6,8; азот - DXj.Ni, i=1,3,6,7,9; кислород - DXj.Oi, i=2,4,6; где Х=G,A,T,C; j=номер основания.
   • Изменила скрипт P:\y05\Term3\dna.def согласно pdb-названиям атомов ДНК на скрипт dna1.def.
   • Определила следующие множества:
     • base — все атомы оснований ДНК;
     • mjg — атомы оснований ДНК, обращённые в большую бороздку;
     • mig — атомы оснований ДНК, обращённые в малую бороздку;
     • pl_deri — полярные атомы 2'-дезоксирибозы;
     • pl_ph — полярные атомы остатков фосфорной кислоты;
     • pl_mjg — полярные атомы азотистых оснований, обращенные в большую бороздку;
     • pl_mig — полярные атомы азотистых оснований, обращенные в малую бороздку;
     • np_deri — неполярные атомы 2'-дезоксирибозы;
     • np_mjg — неполярные атомы азотистых оснований, обращенные в большую бороздку;
     • np_mig — неполярные атомы азотистых оснований, обращенные в малую бороздку.
   • С помощью команды select within( <порог расстояния>, <множество>), а также вспомнив логические операции над множествами, определила количество атомов белка, образующих контакты каждого типа, заполнила таблицу#1.
     
     

     Tаблицa#1 Контакты белка с ...	Полярные	Гидрофобные	Всего
     ... остатками 2'-дезоксирибозы	13	69	82
     ... остатками фосфорной кислоты	39	x	39
     ... остатками азотистых оснований со стороны большой бороздки	0	0	0
     ... остатками азотистых оснований со стороны малой бороздки	3	1	4

     
     
   • Скрипт: script.txt
     
     

     #Script-file for determining the quantity of DNA-protein contacts in DNA-protein complex restrict d? define mjg dc.n4,da.n6,dt.o4,dg.o6,dg.n7,da.n7,dt.c5,dc.c5,dg.c8,da.c8,dt.c6,dc.c6,dg.c5,da.c5 echo #DNA base atoms from major groove define mig dc.o2,dt.o2,dg.n3,dg.n2,da.n3,da.c2 echo #DNA base atoms from minor groove define tocompl dt.o4,dt.n3,dc.n4,dc.n3,dc.o2,dg.o6,dg.n1,dg.n2,da.n6,da.n1 define basen dc.c2,dc.c4,dc.n1,dt.c4,dt.c2,dt.c5,dt.n1,dg.c2,dg.c4,dg.n9,dg.c6,da.c4,da.n9,da.c6 define base mjg,mig,tocompl,basen echo #DNA base atoms, amount to "dna and not backbone" define pl_deri d?.o?' echo #polar atoms from deoxyribose define pl_ph d?.op? echo #polar atoms from phosphates define pl_mjg mjg and (oxygen,nitrogen) echo #polar base atoms from major groove define pl_mig mig and (oxygen,nitrogen) echo #polar base atoms from minor groove define np_deri d?.c?' echo #non-polar atoms from deoxyribose define np_mjg mjg and carbon echo #non-polar atoms from major groove define np_mig mig and carbon echo #non-polar atoms from minor groove echo #now all sets we need are nominated and it is time to begin the count select within (3.5,pl_deri) and protein and (*.n???, *.o???) spacefill 70 color red label %n %r %a %c echo #13 contacts with polar atoms from deoxyribose pause color cpk label off spacefill off select within (3.5,pl_ph) and protein and (*.n???, *.o???) spacefill 70 color red label %n %r %a %c echo #39 contacts with polar atoms from phosphates pause color cpk label off spacefill off select within (3.5,pl_mjg) and protein and (*.n???, *.o???) echo #no contacts with polar atoms from major groove pause select within (3.5,pl_mig) and protein and (*.n???, *.o???) spacefill 70 color red label %n %r %a %c echo #3 contacts with polar atoms from minor groove pause color cpk label off spacefill off select within (4.5,np_deri) and protein and not (*.n???, *.o???) spacefill 70 color blue label %n %r %a %c echo #69 contacts with non-polar atoms from deoxyribose pause color cpk label off spacefill off select within (4.5,np_mjg) and protein and not (*.n???, *.o???) echo #no contacts with non-polar atoms from major groove pause select within (4.5,np_mig) and protein and not (*.n???, *.o???) spacefill 70 color blue label %n %r %a %c echo #1 contacts with non-polar atoms from minor groove pause color cpk label off spacefill off echo #the quantity of polar and non-polar DNA-protein contacts is determined, voila (:

     
     
   • Комментарии:
     • Мой ДНК-белок комплекс состоит из В-ДНК и фермента ДНК-лигазы. ДНК-лигаза катализирует ковалентное сшивание цепей ДНК в дуплексе при репликации, репарации и рекомбинации. Она образуют фосфодиэфирные мостики между 5'-фосфорильной и 3'-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрыва ДНК или между двумя молекулами ДНК.
       
       
       
     • Тринадцатый нуклеотид ДНК - 2',3'-дидезоксицитидин-5'-монофосфат (2',3'-DIDEOXYCYTIDINE-5'-MONOPHOSPHATE), лишён гидрокси-группы при 2'-углероде сахарного кольца, отчего ДНК-лигаза не может сшить разорванную цепь. Такая замена, видимо, даёт возможность получить "стоп-кадр" процесса сшивания цепи.
     • Далее видно, что фермент не контактирует с бороздками, основная область контакта белка и ДНК - сахарнофосфатный остов (остатки фосфорной кислоты и сахарное кольцо). Это очевидно и является следствием функции ДНК-лигазы - сшивания, а целостность цепи ДНК зависит от целостности сахарно-фосфатного остова.
     
     
   • Поиск специфических контактов, обеспечивающих узнавание сайта в молекуле ДНК
     Необходимо предположить, какие остатки белка отвечают за специфичность узнавания белком ДНК, и выбрать наиболее интересный.
     Как выбирала: Воспользовалась генерируемыми скриптом изображениями контактов, однако сначала сделать выбор казалось очень сложным. Имело смысл изучать контакты с углеродами сахарного кольца - их больше всего и они функционально обоснованы. Основным принципом поиска предполагаемых остатков было количество атомов, имеющих контакты с 2'-дезоксирибозой. Поэтому я выбрала:
     • GLU346 (3 атома)
     • LYS770 (3 атома)
     • ARG771 (3 атома)
     • LYS795 (3 атома)
     • PHE872 (7 атомов)
     Наиболее интересным мне показался PHE872, потому что 6 из 7 атомов, образующих контакты с ДНК, являются атомами фенильного кольца - возможно контакт с этим кольцом наиболее специфичен. Тем более, посмотрите (!!!), PHE872 находится именно там, где цепь разорвана!
     Скрипт для получения изображения контакта ДНК-Phe872 (script1.txt):
     
     

     # Script-file for getting image of contact DNA-Phe872 background white set fontsize 13 set fontstroke 1 color label green restrict dt2, dg1, dt12, dg11, 872 wireframe 40 center select dg1.c1' spacefill 100 define ring *.cb,*.cd1,*.cd2,*.ce1,*.ce2,*.cz,*.cg select ring and 872 spacefill 100 bond 4660 5129 + select ???.cd2 and 872 label Phe 872 select dt2.op2 label T2 select dg1.op1 label G 1 select dt12.o5' label T 12 select dg11.p label G 11

     
     
   • Описание функций исследованного белка
     
     
     • #описание заданного белка в UniProt:
       
     • #описание ДНК-связывающего домена - DNA ligase N terminal в Pfam:
     • Кратко о функции белка: Этот белок сшивает несоединённые участки двухспиральной ДНК. (This protein seals, during DNA replication, DNA recombination and DNA repair, nicks in double-stranded DNA.)
     • Кратко об особенностях семейства DNA_ligase_A_N: Этот домен есть у многих, но не у всех АТР-зависимых ДНК лигаз (EC:6.5.1.1). Как известно, он принимает участие в связывании с ДНК и в катализе. У человека и Saccharomyces cerevisiae этот домен необходим для катализа и отделён от N-сайта терминации транскрипции (amino terminus).
     • Консервативность фенилаланина в 872-ой позиции проверить не получилось. Существует три известных ДНК-связывающих домена: 771-836 -> DNA_ligase_A_C, 542-746 -> DNA_ligase_A_M, 287-465 -> DNA_ligase_A_N. При попытке получить множественное эталонное вравнивания для семейства ДНК-лигаз выяснилось, что выравнены только домены, а не полные последовательности белков, к сожалению...потому что действительно было очень интересно, является ли консервативным этот остаток. Поскольку мне дан домен DNA_ligase_A_N, я проверила, является ли консервативным остаток GLU346, он образует с ДНК три контакта. И действительно, он является консервативным:
       
   • Построение схемы контактов белка с ДНК
     Воспользвалась программой nucplot.
     
     Комментарии:
     • Как видно, программа показала гораздо меньше контактов, чем было найдено вручную, поскольку скорее всего предъявляет более жёсткие требования.
     • Однако явно наблюдается преобладание гидрофобных котактов, как и в таблице.
     • Для GLU346 показано больше контактов, чем найдено вручную. Видимо, именно этот остаток является специфичным для домена DNA_ligase_A_N.
     • Остаток Phe872 проигнорирован. Я не знаю, с чем это связано, потому что значимость этого остатка не вызывает у меня никаких сомнений. На нукплотовской схеме не показаны 1-ый и 2-ой нуклеотиды, с которыми и связан фенилаланин, видимо, поэтому программа его не обозначила.
     • !Вывод: Исследуя котактирование белка и молекулы ДНК, я первоначально проводила бы ручной поиск контактов, а затем пользовалась nucplot в качестве проверки и выявления наиболее значимых и специфичных контактов.