Занятие 10

Проект "Поиск белка с заданной функциональной специфичностью."

  1. Первый этап: описание функциональных особенностей заданной группы.

    2. Мне был выдан белок-прототип MALI_ECOLI, выделенный из кишечной палочки Escherichia coli K-12. Имя гена - malI, длина последовательности 342 аминокислотных остатков.

    Я произвела поиск информации о заданном белке в базе данных EcoCyc. Страница с описанием белка MALI_ECOLI.

    MalI - мальтозный репрессор, который контролирует гены, относящиеся к мальтозной системе. Он отрицательно саморегулируется и координационно репрессирует транскрипцию оперона, который кодирует мальтоза-глюкоза PTS пермеазу (фермент, участвующие в транспорте метаболитов) и бифункциональный белок, который взаимодействует с активатором транскрипции MalT.

    Термины GO, связанные с белком MALI_Ecoli:

    GO Онтология GO (название словаря) Термин
    GO:0006355 biological process regulation of transcription, DNA-dependent
    GO:0045449 biological process regulation of transcription
    GO:0006350 biological process transcription
    GO:0003677 molecular function DNA binding
    GO:0003700 molecular function transcription factor activity
    GO:0005622 cellular component intracellular


    Где?
    (cellular component)     		Внутриклеточный
    Зачем, для чего?
    (biological process)     		Транскрипция; регуляция ДНК-зависимой транскрипции
    Молекулярный механизм?
    (molecular function)    		 Связывание с ДНК; активность транскрипционного фактора
    Специфичность?
    (molecular function)    		 -

    Следовательно, в аннотации GO нет информации об эффекторе белка MALI_ECOLI - мальтозе.
    Структурная формула мальтозы (БД KEGG, ID C00208):

  2. Второй этап: создание множественного выравнивания доменов с разметкой по группам специфичности.

    1. Создание хорошего множественного выравнивания доменов заданной группы белков

      2. Доменная структура белка MALI_ECOLI (информация из БД Pfam):

      Cхема из Pfam:
      Пояснения к схеме
      Pfam AC Pfam ID Положение в последовательности белка MALI_ECOLI Клан
      PF00356 LacI 8-53 HTH (CL0123)
      PF00532 Peripla_BP_1 64-342 Periplas_BP-like (CL0144)

      Домен LacI (зеленый) является ДНК-связывающим, домен Peripla_BP_1 (красный) - эффекторсвязыюващий домен.
      Полученное выравнивание всех эффекторсвязывающих доменов даного типа в fasta-формате.
      С помощью скрипта из общего выравнивания добудем выравнивание нужных доменов.Их идентификаторы находятся в файле mali
      В файле PF00532_mali.fasta находится множественное выравнивание эффектор-связывающих доменов группы спецефичности mali.

    2. Создание единого множественного выравнивания заданных доменов всех групп специфичности

      3. При выполнение предыдущего задания так же было обнаружено, что в списке всех белков присутствуют не все, имеющие, по мнению эксперта, данную спецефичность. Их последовательности были найдены отдельно и добавлены в список.
      Полученное выравнивание было импортировано в GeneDoc и там раскрашено по группам спецефичности (mali показана зеленым цветом).
      Полное выравнивание с раскраской по группам спецефичности. В нем имеется консервативная для всех позиция 145 (покрашена черным).Колонки букв, окрашенные цветом, совпадающим с цветом названия белков, указывают на позиции, консервативные в доменах соответствующей группы специфичности. Наблюдаются так же консервативные позиции хотя бы для 6 групп спецефичности - колонки 36,58,62,98,117,137,189,219 и еще несколько. Консервативными в пределах набора последовательностей считали позиции, представленными одинаковыми аминокислотными остатками или аминокислотными остатками, входящими в одну группу сходства. Группы сходства (как в GeneDoc): (D,N), (E,Q), (S,T), (K,R), (F,Y,W), (L,I,V,M)
      Длинных консервативных участков в моей группе спецефичности не нашлось - всего колонок с одними и теми же остатками для всей группы - 62, но самые длинные консервативные участки - с 4-8 и 123-127, т.е.4-5 а.к.остатков.

    3. Ресурс WebLogo

      4. Я получила изображения для полного выравнивания.
      И для моей группы спецефичности.
      Изображение полного выравнивания эффекторсвязывающих доменов демонстрирует консервативность разных остатков на разных позициях в эффекторсвязывающих доменах всего семейства.
      Из картинки видно, что "большие" буквы на лого совпадают с выделенными колонками, консервативными в полном выравнивании эффекторсвязывающих доменов.
      Изображение выравнивания доменов группы специфичности mali иллюстрирует консервативность остатков в эффекторсвязывающих доменах исключительно данной группы специфичности.

    4. Третий этап: Создание профиля для доменов белков заданной группы специфичности

      5. 1). Сначала я получила выравнивание Днк-связывающих доменов группы специфичности mali. Использовала домен из БД SMART, так как длина ДНК-связывающего домена SM00354 из БД SMART превосходит длины ДНК-связывающих доменов из других баз. Воспользовалась ссылкой на SM00354. Представительское выравнивание сохранено в файл SMART.fasta.

      Последовательности всех бактериальных белков, содержащих домены данного семейства сохранены в файл family.fasta Было обнаружено, что в файле family.fasta, полученном из БД SMART, отсутствует один из белков, указанных в списке идентификаторов последовательностей, по мнению эксперта, обладающих данной специфичностью. Эта последовательность была получены из БД UniProt. Был запущен следующий скрипт: 

      	#!/bin/bash
	for i in `cat mali`; do
	grep -A 5 ${i} family.fasta >> family_sort.fasta
	done
      Данный скрипт ищет в файле family.fasta последовательности из списока, лежащего в файле mali. Для правильной работы скрипт и список должны быть сохранены в UNIX-формате. Выдача скрипта: файл family_sort.fasta. Я приписала к данному файлу последовательность белка B5XRE8. С помощью программы ClustalW2 последовательности белков, содержащих нужные ДНК-связывающие домены были выровнены под профиль представительского выравнивания SMART.fasta. Из полученного файла с выравниванием были вырезаны представительские последовательности и позиции выравнивания, не содержащие ДНК-связывающего домена. Полученное выравнивание было сохранено в файл dna_mali.fasta

      2). Далее по этому выравниванию был построен профиль.

      1. C помощью программы pfw к выравниванию добавим веса: 

       
pfw -m dna_mali.fasta > mali.pfw.fasta
      2. C помощью команды pfmake построили профиль: 
      pfmake -m mali.pfw.fasta /usr/share/pftools23/blosum45.cmp > mali.pfw.pfmake.pfl
      3. С помощью команды autoscale нормируем полученный выше профиль относительно случайной базы: 
      autoscale -m mali.pfw.pfmake.pfl > mali.pfw.pfmake.autoscale.pfl
      4. С помощью программы pfsearch проведем поиск по протеому по профилям.

      Дан файл Pantoea.fasta, по которому и будем осуществлять поиск: 

       pfsearch -f mali.pfw.pfmake.autoscale.pfl Pantoea.fasta >  mali.pfw.pfmake.autoscale.pfsearch.list
 pfsearch -x -f mali.pfw.pfmake.autoscale.pfl Pantoea.fasta > mali.pfw.pfmake.autoscale.pfsearch
      5. Был получен файл со списком находок и файл с последовательностями находок. Всего нашлось 23 белка.

      С помощью программы ClustalW2 последовательности найденных белков были выровнены с ДНК-связывающими доменами группы специфичности mali. Далее выравнивание было импортировано в GeneDoc. Изображение выравнивания:

      Для проверки важных позиций, воспользуемся БД PDB. Но в БД PDB не нашлось ни одной 3D-структуры белка группы специфичности mali. Я не обнаружила полностью консервативных позиций в выравнивании, поэтому можно сделать вывод, что найденная мной последовательность не принадлежит нашей группе специфичности.
       


      <<Обратно на четвертый семестр
      <<Обратно на главную страницу

      ©Лелекова Мария,2010