Исследование ДНК-белковых взаимодействий

Исследование ДНК-белковых взаимодействий в структуре комплекса белков(факторы транскрипции DP-2 и E2F-4) и фрагмента ДНК.

1) Краткое описание структуры в файле 1CF7.pdb

Молекулы взяты из организма человека (HOMO SAPIENS). В файле рассматриваются следующие молекулы:
1)Фрагмент ДНК, состоящий из двух комплементарных цепей - C и D.
2)ДНК-связывающий домен белка (фактор транскрипции E2F-4). Одна цепь - A.
3)ДНК-связывающий домен белка (фактор транскрипции DP-2). Одна цепь - B.
Вот так выглядит выглядит описание структуры в PDB: 
Molecule:	DNA (5'-D(*AP*TP*TP*TP*TP*CP*GP*CP*GP*CP*GP*GP*TP*TP*TP*T)-3')
Polymer:	1	Type:	polydeoxyribonucleotide	Length:	16
Chains:	C
Fragment:	ADENOVIRUS TYPE 5 E2 PROMOTER E2F-BINDING SITE
Molecule:	DNA (5'-D(*TP*AP*AP*AP*AP*CP*CP*GP*CP*GP*CP*GP*AP*AP*AP*A)-3')
Polymer:	2	Type:	polydeoxyribonucleotide	Length:	16
Chains:	D
Fragment:	ADENOVIRUS TYPE 5 E2 PROMOTER E2F-BINDING SITE
Molecule:	PROTEIN (TRANSCRIPTION FACTOR E2F-4)
Polymer:	3	Type:	polypeptide(L)	Length:	76
Chains:	A
Fragment:	DNA-BINDING DOMAIN
Molecule:	PROTEIN (TRANSCRIPTION FACTOR DP-2)
Polymer:	4	Type:	polypeptide(L)	Length:	95
Chains:	B
Fragment:	DNA-BINDING DOMAIN

Для исследования были выбраны:
Цепь А белка(фактор транскрипции E2F-4),
Цепь B белка(фактор транскрипции DP-2) и цепи С и D, представляющие ДНК со следующей последовательностью:

цепь C [501] 5' - attttcgcgcggtttt  - 3' [515] 
                   |||||||||||||||  
цепь D [615] 3' -  aaaagcgcgccaaaat - 5' [601],

где 501 и 515 - номера первого и последнего нуклеотида.

1)TRANSCRIPTION FACTOR DP-2 (Идентификатор БД SwissProt Q14188)
Can stimulate E2F-dependent transcription. Binds DNA cooperatively 
with E2F family members through the E2 recognition site, 5'-TTTC[CG]CGC-3', 
found in the promoter region of a number of genes whose products are involved 
in cell cycle regulation or in DNA replication. The DP2/E2F complex functions 
in the control of cell-cycle progression from G1 to S phase. 
The E2F-1/DP complex appears to mediate both cell proliferation and apoptosis.
Перевод: Может стимулировать E2F-зависимую транскрипцию.Связывает ДНК совместно с членами семейства E2F на сайте распознавания, 5'-TTTC[CG]CGC-3', найденном в промоторной области некоторого числа генов, чьи продукты вовлекаются в регуляцию клеточного цикла или репликацию ДНК.

2)TRANSCRIPTION FACTOR E2F-4 (Идентификатор БД SwissProt Q16254)
Transcription activator that binds DNA cooperatively with DP proteins 
through the E2 recognition site, 5'-TTTC[CG]CGC-3' found in the promoter region 
of a number of genes whose products are involved in cell cycle regulation 
or in DNA replication. The DRTF1/E2F complex functions in the control of 
cell-cycle progression from G1 to S phase. E2F-4 binds with high affinity 
to RBL1 and RBL2. In some instances, can also bind RB protein.
Перевод:Активатор транскрипции который связывает ДНК совместно с DP белками на сайте распознавания, 5'-TTTC[CG]CGC-3', найденном в промотерной области некоторого числа генов, чьи продукты вовлекаются в регуляцию клеточного цикла или репликацию ДНК. DRTF1/E2F комплекс функций, контролирующих развитие клеточного цикла от G1 к S фазе. E2F-4 связывается c родственными белками RBL1 и RBL2.В некоторых случаях, могут также связывать RB белок.

2) Функции белков, структуры которых представлены в файле 1CF7.pdb

Белок (фактор транскрипции DP-2)

Оригинальный текст

Может стимулировать E2F-зависимую транскрипцию.Связывает ДНК совместно с членами
семейства E2F на сайте распознавания, 5'-TTTC[CG]CGC-3', найденном в промоторной
области некоторого числа генов, чьи продукты вовлекаются в регуляцию клеточного цикла или репликацию ДНК.

Белок (фактор транскрипции E2F-4)

Оригинальный текст

Активатор транскрипции который связывает ДНК совместно с DP белками на сайте распознавания, 5'-TTTC[CG]CGC-3',
найденном в промотерной области некоторого числа генов, чьи продукты вовлекаются в регуляцию клеточного цикла или репликацию ДНК.
DRTF1/E2F комплекс функций, контролирующих развитие клеточного цикла от G1 к S фазе.
E2F-4 связывается c родственными белками RBL1 и RBL2.В некоторых случаях, могут также связывать RB белок.

3) Исследование структуры ДНК

1.Исследование структуры ДНК с помощью программ find_pair и analyze.

С помощью вышеуказанных программ получен файл DNA_old.out
Исходя из полученных данных мы имеем дело с ДНК в B-форме.

2.Определение средних значений торсионных углов для внутренних нуклеотидов(всех, кроме краевых).

Из файла DNA_old.out была взята информация для построения Excel-таблицы.
Таблицы в этом файле:
Первая таблица - выдержка из файла DNA_old.out.
Вторая таблица - отрицательные углы были переведены в соответствующие положительные.
Указаны средние значения каждого из углов.
Третья таблица - показывает отклонение величины каждого угла от среднего значения для этого угла.
Синим обозначен самый "кривой" нуклеотид, среднее значение которого наиболее отклоняется от других
Резюме:
По данным Excel таблицы можно сказать что деформация для всех нуклеотидов
распределена неравномерно.
Участки сильно отклоняющихся нуклеотидов чередуются со слабо отклоняющимися.
Основной участок деформации отмечен желтым.

4) Исследование природы ДНК-белковых контактов

Описать ДНК-белковые контакты в заданной структуре. Сравнить количество контактов разной природы.

Будем считать полярными атомы кислорода и азота, а неполярными - атомы углерода, фосфора и серы.
Назовем полярным контактом ситуацию, в которой расстояние между полярным атомом белка и полярным атомом ДНК
меньше 3.5A. Аналогично, неполярным контактом будем считать пару неполярных атомов на расстоянии меньше 4.5A.
В скрипте my_dna.def приведены команды для выделения в RasMol множеств, необходимых для определения числа контактов.

Таблица:


Контакты разного типа в комплексе 1CF7.pdb

Контакты атомов белка с Полярные Неполярные Всего
      остатками 2'-дезоксирибозы 8 19 27
      остатками фосфорной кислоты 17 17 34
      остатками азотистых оснований со стороны большой бороздки 7 15 22
      остатками азотистых оснований со стороны малой бороздки 2 1 3


Резюме

Наибольшее число контактов обнаружено с остатками фосфорной кислоты.
Скорее всего данные атомы расположены на поверхности молекулы ДНК и доступны
для взаимодействия с атомами белка.

Контакты атомов белка с остатками азотистых оснований со стороны бороздок
Из таблицы видно, что атомы белка "легче" контактируют с основаниями из большой бороздки чем из малой.Это по-моему мнению связано с тем, что большая бороздка в силу своей глубины наиболее предрасположена для сближения с белком и лучшего связывания.

5) Получение популярной схемы ДНК-белковых контактов с помощью nucplot


Использованная в Putty команда:
>nucplot 1CF7_old.pdb

Полученные картинки

Сравнивая картинку из nucplot и расчеты из Excel файла можно сделать вывод
о том, что контакты с белком не влияют на "искривления" нуклеотидов.
Так наиболее искривленный нуклеотид из таблицы не имеет контакта (атом белка-основание) с белком. Зона, покрашенная в таблице желтым, также не имеет контактов с атомами белка.


Видно что результаты, полученные с помощью программы nucplot и результаты о контактах белка и ДНК в RasMol, не совпадают.
По данным nucplot присутствуют:
16 контактов между белком и остатками фосфорной кислоты и всего 9 контактов между атомами азотистых оснований и атомами ДНК. Все это выявляет различия между алгоритмом определения контактов в этих случаях.

6)Возможные распознающие контакты

На роль распознающих я выбрал 2 контакта.
Первый контакт
аминокислоты ARG122 (цепь B - белка (фактор транскрипции DP-2) и нуклеотида DG609 (рис.слева).
Второй контакт
аминокислоты ARG17 (цепь A - белка (фактор транскрипции E2F4-4) и нуклеотида DC505 (рис.справа).
Причины выбора:

1.Контакт аминокислоты с основанием нуклеотида.
2.Нахождение рядом еще нескольких контактов( аминокислота-основание нуклеотида ).
Картинка взаимодействия аминокислота - нуклеотид

7) Характеристика ДНК-связывающего домена E2F_TDP

Доменная структура белка из исследуемого комплекса, полученная с помощью инструментов Pfam

Белок (транскрипционный фактор DP-2)



Source Domain Description Start End
Pfam-A E2F_TDP E2F/DP family winged-helix DNA-binding domain 127 208
Pfam-A DP Transcription factor DP 215 360


Белок (транскрипционный фактор E2F-4)



Source Domain Description Start End
Pfam-A E2F_TDP E2F/DP family winged-helix DNA-binding domain 17 83


Семейство E2F/DP winged-helix Днк-связывающего домена.

Это семейство включает фактор транскрипции E2F и его димеризованных партнеров TDP1 и TDP2, которые стимулируют E2F-зависимую транскрипцию. E2F связывает Днк как гомодимер или как гетеродимер в комплексе с TDP1/2, гетеродимер повышает эффективность связывания. Кристалическая структура E2F4-DP2-DNA комплекса показывает, что Днк-связывающие домены E2F
и DP белков имеют сгиб, относящийся к winged-helix Днк-связывающего мотива.

Отдельно о транскрипционном факторе DP

DP формы образуют гетеродимер с E2F.Получившийся E2F1-DP1 гетеродимер регулирует гены, вовлеченные в цикл клеточного развития. Транскрипционная активность E2F ингибируется белком ретинобластомы, который связывается с E2F-DP
гетеродимером и негативно регулирует G1-S развитие.

Назад