Проект "Поиск белка с заданной функциональной специфичностью."

 

Задача: определить, есть ли эффектор-связывающий белок в заданном протеоме. Возможно, что такого нет, но это надо обосновать.


  1. Описание функциональных особенностей заданной группы (белка - прототипа RBSR_Ecoli).

    2. В качестве белка-прототипа был задан белок из кишечной палочки, описание его свойств найдем на сайте EcoCyc.

    Белок RbsR_Ecoli представляет собой репрессор рибозного оперона.
    Имя гена - rbsR.
    Длина - 330 а.о.
    Молекулярный вес белка: 36.612 kD
    pI: 5.32
    Реакция : D-ribose + RbsR = RbsR-ribose

    Функции в GO :

    Biological Process: GO:0006350 - транскрипция;
    GO:0006355 - регуляция транскрипции;
    GO:0016052 - карбогидратный каталитический процесс
    Molecular Function: GO:0005515 - связывание с белком
    GO:0003677 - связывание с ДНК
    GO:0003700 - транскрипционный фактор активности
    GO:0016564 - транскрипционный репрессор активности
    Cellular Component: GO:0005622 - внутриклеточный
    GO:0005737 - цитоплазма


    Транскрипция этого оперона начинается, когда существует недостаток глюкозы и когда физиологический индуктор, D-рибоза, связывается с геном - репрессором RbsR. Когда D-рибоза связывается с RbsR, белок становится инактивированным, потому что уменьшается его аффиность к связыванию.

  2. Создание множественного выравнивания доменов с разметкой по группам специфичности.

    1. Создание хорошего множественного выравнивания доменов группы белков frur.

      2. Доменная структура белка rbsR_Ecoli была найдена в БД PFAM.

      Эффектор-связывающий домен - Peripla_BP_1. Выравнивание эффекторсвязывающих доменов возьмем для него из этой же БД. Скачаем выравнивание всех доменов этого типа в формате FASTA.
      Затем получим скрипт для того, чтобы из полного выравнивания получить выравнивание нужных доменов, которые заданы в файле frur.

      chmod +x scr.scr
./scr.scr
      Файл с выравниванием сохраним в рабочей директории с названием PF00532_frur.fasta, где PF00532-идентификатор домена, frur - имя группы специфичности.

    2. Создание единого множественного выравнивания эффекторных доменов всех групп специфичности.

      3. Выравнивание заданных для исследования доменов импортируем в Genedoc и объявим его последовательности новой группой (кнопка меню "Groups=>Edit sequence groups"). Назовем группу. Зададим также цвет для маркировки последовательностей этой группы.
      Затем последовательно будем добавлять по одному выравниванию доменов с разной специфичностью (кнопка "S"), каждый раз объявляя новую группу.
      Получим раскраску по группам (меню "Groups"), наиболее наглядно иллюстрирующую различия между группами. Сохраним полученное выравнивание. Изображение раскрашенного выравнивания тоже сохраним.

      Группы окрашены: 

      galrs     - темно-синий
gntr      - серо-зеленый
ptxs      - рыжий
purr      - бурый
scrr      - тсветло-голубой
thur_rafr - серый
trer      - серо-голубой
laci      - розовый
mali      - фиолетовый
rbsr      - желтый
frur      - зеленый

      В позиции 5 этих выравниваний наблюдается практически полностью консервативный участок, кроме thur_rafr и trer в их последовательностях встречаются гепы на этих участках. Так же практически полностью совпадает позиция 85, 112, 145. Если внимательно рассмотреть rbsr выравнивание, то заметно, что большинство консервативных участков совпадает с аналогичными консервативными участками в других группах.

    3. Создание лого-изображения полного выравнивания эффекторных доменов и выравнивания доменов группы специфичности rbsr.

      4. Используем ресурс WebLogo. Получили лого-изображение всех эффекторных доменов, а так же лого-изображение для группы rbsr

    4. Добавление веса в выравнивание.

      5. Выполняем с помощью pwf из пакета PFTOOLs: 
      pfw -m PF00532_rbsr.fasta > out.weighted.fasta

    5. Построение профиля.

      6. Выполняем с помощью команды:
      pfmake -m out.weighted.fasta /usr/share/pftools23/blosum45.cmp > myprofile.prf
      Затем нормируем профиль относительно случайной базы, выполняем следующим образом:
      autoscale -m myprofile.prf > myprofile.scaled.prf
      Нормированный профиль так же сохраняем.

    6. Поиск по профилю в выборке последовательностей

      7. Выполняем с помощью команды: 
      pfsearch -C 10.0 -f myprofile.scaled.prf Marinomonas.fasta > marim.search
      Получаем файл, в котором указан номер белка и его длина.
      Получилось, что подходит только 1 белок: 
      > 1851
MSSTIKDVALRAGVSTTTVSHVLNKTRFVAKTTQERVFQAAEELNYAPSAVARSLKVKNTKSLGMLVTTT
LNPFFAELVNEVEKCCYREGYNLVLCNTDGELEKTNSYLRMLTQKRVDGILVMCSAYDDSLFSSLIGQRN
LPMVVMDWGPSDDYVDRIQDNSVKGAHLAIQHLIEQGHKRIAYIGGPLEKLPAKQRLDGFMEAMEQANLP
VQGDWVIESDFEFEGGKLGMRQLLSCHNLPSAVFVANDAMAMGAMSEAQLSGVKIPQQLSIIGYDNCMYS
AYFSPPLTTINQPKERLAELAISTMIERIENPRQEGKMIMLEPNLVVRSSVAAVSAE

      Выравнила с помощью muscle данный белок с последовательностями из выравнивания сделанного ранее.

      Далее, мною была найдена структура белка-предшественника RBSR_ECOLI c рибозой. Затем получила аминокислоты, которые взаимодействуют с белком на расстоянии 3.5А:

      Получила список аминокислот:

        ASN 13   N
  PHE 16   F
  ASP 89   D
  ARG 90   R
  ALA 137  A
  ARG 141  R
  ASN 190  N
  ASP 215  D
  GLN 235  Q

      После этого смотрим, чтобы эти аминокислоты были консервативны в найденных позициях.

      На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что данный белок связывается с рибозой, то есть выполняет такую же функцию как и белок-предшественник.

      © Пискунова Юлия 2010