Работа с программой PSI-BLAST.

На главную страницу второго семестра

Поиск гомологов белка LGB1_LUPLU (P02239) в БД SwissProt с помощью программы BLASTP.

Пользуясь программой BLASTP на сервере NCBI (меню BLAST, а в открывшемся списке вариантов — программа blastp), был проведен поиск гомологов белка LGB1_LUPLU (P02239);
параметры поиска следующие (все значения из нижеперечисленных, кроме Number of Descriptions, были приняты "по умолчанию"):

учет особенностей аминокислотного состава (Compositional adjustments) — no adjustment (нет; не включен);
фильтрование областей низкой сложности - включено;
максимальное значение E-value - 10;
максимальное количество находок (Number of Descriptions ) - 1000.

Следующий этап: исследование, в каких таксонах обнаружены гомологи (для этого использован фильтр по таксонам на страничке "formatting Blast"). Результаты поиска представлены в таблице.

Таблица 1. Поиск гомологов белка LGB1_LUPLU (AC P02239) в БД SwissProt.
[Параметры программы blastp - см.выше.]

	Кол-во	E-value лучшей находки	Название лучшей находки (ID )	% идентичности	Длина выравнивания
Всего находок	117	5x10^–82	LGB1_LUPLU	100	154
В бактериях (Bacteria)	36	10^–6	HMP_RHIME	29	117
В Escherichia coli K-12	0	-	-	-	-
В животных (Metazoa)	26	2x10^–6	NGB_BRARE	25	141
В человеке	3	5.8	CRNL1_HUMAN	28	78

Наблюдения:
не удалось обнаружить гомологов среди белков человека и кишечной палочки (белки кишечной палочки указанному порогу значений e-value не удовлетворяют; в случае с белками из организма Homo sapiens минимальное e-value составило 5.8 - все-таки, в случае гомологов, должно оно быть меньше). Возможное объяснение происходящего: по моим наблюдениям, чуть меньше половины всех находок - белки растений. LGB1_LUPLU (леггемоглобин-1; Leghemoglobin-1 (Leghemoglobin I)) фактически "спасает" азотфиксирующих симбионтов растений (бобовые) от губительного для них действия О₂ - весьма специфичная функция; отлична, естесственно,от функции CRNL1_HUMAN...
Таким образом, BLASTP оказывается неэффективным при поиске далеких гомологов.

Поиск гомологов белка LGB1_LUPLU (P02239) в БД SwissProt с помощью программы PSI-BLAST.

Пользуясь программой PSI-BLAST на сервере NCBI (меню BLAST, а в открывшемся списке вариантов — программа PSI-BLAST), был проведен поиск гомологов белка LGB1_LUPLU (P02239);
параметры поиска следующие (совпадают с параметрами поиска из предыдущего упражнения):

учет особенностей аминокислотного состава (Compositional adjustments) — no adjustment (нет; не включен);
фильтрование областей низкой сложности - включено;
максимальное значение E-value - 10;
максимальное количество находок (Number of Descriptions ) - 1000.

Проведено 5 итераций ( поиск велся до тех пор, пока в списке значимых находок не перестaли появляться новые последовательности). Результаты поиска представлены в таблице:

Таблица 2. Итерационный поиск гомологов LGB1_LUPLU (P02239) в БД SwissProt с помощью программы PSI-BLAST.
[Параметры программы - см.выше.]

Номер итерации	Бактерии		Животные		Характеристика лучшей находки среди белков
	Бактерии		Животные		Escherichia coli, K-12				Homo sapiens sapiens
	Кол-во	Новые	Кол-во	Новые	Название	E-value находки	% идентичности	Длина выравнивания	Название	E-value находки	% идентичности	Длина выравнивания
1	21	+	5	+	Нет находок				CRNL1_HUMAN	5,8	28	78
2	38	+	332	+	HMP_ECOLI	10^-29	20	148	NGB_HUMAN	2x10^-19	21	143
3	38	-	879	+	HMP_ECOLI	6x10^-28	20	148	HBG2_HUMAN	8x10^-45	18	150
4	38	-	884	+	HMP_ECOLI	2x10^-22	20	143	HBE_HUMAN	5x10^-54	17	154
5	38	-	884	-	HMP_ECOLI	2x10^-22	19	143	HBE_HUMAN	7x10^-54	17	154

По умолчанию программа PSI-BLAST строит профиль PSSM по последовательностям с E-value<0.005. В столбец "Кол-во" таблицы записанo только количество таких находок.

Для решения каких задач нужно использовать PSI-BLAST?

В результате проведенной работы были найдены гомологи LGB1_LUPLU (из Lupinus luteus - царство Plantae) из различных организмов ("далеких" по таксономическому положению), в том числе и из организмов человека (H. sapiens - царство Metazoa) и кишечной палочки (E.coli - царство Bacteria); этого не удалось сделать программой BLASTP.
Таким образом, PSI-BLAST оказывается высокоэффективным при поиске далеких гомологов.

Что представляет собой первая итерация PSI-BLAST?

В случаях упр.1 и упр.2 были заданы одинаковые параметры поиска. Что получилось после 1ой итерации в упр.2? Фактически, то же, что и в результате поиска с использованием BLASTP (упр.1). Действительно, абсолютно одинаковые результаты - см. таблицы 1 и 2. НО: в таблице2/графы "Количество", еще раз напоминаю, указано количество только тех находок, дл которых E-value<0.005. В то время как "всего" их - 36 для Bacteria и 26 для Metazoa.
Таким образом, первая итерация PSI-BLAST соответствует поиску с помощью программы BLASTP.

Что удалось найти в результате упражнения №2?

Были найдены сотни последовательностей белков из самых различных таксонов, сходны с LGB1_LUPLU. Обосновано утверждать, что это гомологи, ведь они объединены общей функцией - перенос кислорода (гемо-, миоглобины, флавогемопротеины...).

Что происходит с "лучшими находками" на разных итерациях?

С каждой новой итерацией изменялись Е-value, процент идентичности и длина выравнивания для лучшей находки; изменялась и сама "лучшая находка"(для случая Homo sapiens sapiens) - это отражено в таблице.
Как изменялось Е-value: в случае HMP_ECOLI оно увеличивалось/не уменьшалось от итерации к итерации; в случае "находок" из Homo sapiens sapiens Е-value уменьшалось (до 4ой итерации), а затем увеличилось. Причины этого заключаются в том, что поиск осуществляется с использованием профиля PSSM (PSSM составлен по результату множественного выравнивания последовательностей-"находок" предыдущей итерации). С каждой новой итерацией профиль "претерпевает изменения" в соответствие с находками (изменения числа находок/значимости позиций последовательности), отсюда вытекает изменение Е-value.

Возможны 2 стратегии. Первая состоит в том, чтобы на каждой итерации вести поиск по всем организмам. Вторая состоит в том, чтобы после первой итерации отфильтровать находки по интересующему таксону, и затем запустить следующие итерации. Какие отличия можно ожидать в результатах?

Следование 1ой стратегии приведет к тому, что "на выдаче" окажется максимальное число гомологов белка, чья последовательность "подана на вход". Причем эти гомологи - из организмов различных таксонов. Этой стратегии мы придерживались при выполнении предыдущего задания и весьма успешно отыскали гомологи белка LGB1_LUPLU из желтого люпина Европейского в организмах человека и кишечной палочки.
Если придерживаться второй стратегии, то результатом поиска станут только последовательности белков организмов, принадлежащих определенным таксонам.
Объяснение: в случае первой стратегии профиль PSSM оказывается более "мягким" (поиск только по наиболее консервативным а.о.). Вторая стратегия: профиль куда более "строгий", специфичный, ведь строится он на основании множественного выравнивания последовательностей более сходных.

Определить, какие остатки контактируют с гемом в "лучших находках" среди белков человека. Проверить, сохраняются ли эти аминокислотные остатки в LGB1_LUPLU, а также в "лучшей" находке среди белков кишечной палочки. Сделайть выводы из полученных результатов.

Результаты поиска (по данным UniProt):

HBE_HUMAN: His63 и His92
HBG2_HUMAN: His63 и His92
NGB_HUMAN: His64 и His96
CRNL1_HUMAN - с гемом не взаимодействует
LGB1_LUPLU: His63 и His97
HMP_ECOLI: His85

Что получается: "лучшая" находка - по результатам первой итерации - из белков человека совсем не взаимодействует с гемом, значит и гомологом не является. Остальные "находки" и LGB1_LUPLU с гемом контактируют через гистидины, которые, в свою очередь, подразделяются на дистальные и проксимальные (исключение - белок кишечной палочки, остается только проксимальный остаток гистидина).

Сохранить файл с профилем PSSM. Объяснить, что в нем написано, как это можно использовать.

Естественно, что от итерации к итерации профиль PSSM отличается - все качественнее и качественее становится поиск. Вот профиль PSSM (в шестнадцатиричной кодировке ASCII - просто жуть, ничего не понятно :-)) после пятой итерации. Его можно использовать при поиске в BLASTP и PSI-BLAST.
***Общее число строк равно 154, число столбцов - 21 (20 столбцов соответствует 20 аминокислот, 21ый столбик - штраф за вставку/ делецию).
Вся информация о профилях содержится в статье Profile analysis: Detection of distantly related proteins (Michael Gribskov, Andrew В. McLachlan, David Eisenberg; 1987).