Занятие 9. Исследование белок-нуклеиновых контактов.

Исследование контактов между белком и нуклеиновой кислотой в документе со структурой биологической единицы (PDB-код 1TKD).

Файл с биологической единицей не отличается от файла с реальной структурой. В дальнейшей работе используется файл с биологической единицей.

Исследование контактов между молекулами белка и нуклеиновой кислоты

Для выявлеения белок-нк контактов используем скрипт, а также файл dna.def с заданными определениями атомов большой и малой бороздок.

При поиске полярных контактов использовался порог расстояния в 3,5 Å, а при поиске неполярных - 4,5 Å.

Таблица. Контакты разного типа в комплексе Т7 ДНК полимеразы с ДНК сайта элонгации.

	Полярные	Гидрофобные	Всего
Контакты белка с ...
... остатками 2'-дезоксирибозы	9	4	13
... остатками фосфорной кислоты	10	таких не бывает	10
... остатками азотистых оснований со стороны большой бороздки	0	1	1
... остатками азотистых оснований со стороны малой бороздки	2	1	3

Больше всего полярных контактов белка с кислородами сахарофосфатного остова. Вероятно, это связано с тем, что белок является ДНК полимеразой, для которой важно узнавать не определенный участок (как для фактора транскрипции, например), а цепь ДНК в общем. При поиске контактов некоторые потенциальные контакты отбрасывались, если они не могли быть реально осуществлены (нет водородной связи по причине отсутствия водорода у обоих контактирующих атомов) или мог быть осуществлен более выгодный контакт (выгоднее контакт с коцевым азотом или кислородом, чем с предшествующими им атомами углерода). Если полярные контакты в большинстве своем двухатомные, то неполярные - многоатомные, в таком случае контактом считалась компактная группа "гидрофобных" атомов.

Поиск специфических контактов, обеспечивающих узнавание сайта в молекуле ДНК.

Можно предположить, что за узнавание сайта ДНК отвечают остатки аргинина Arg111 и Arg604, которые связываются с атомами кислорода фосфатной группы и, возможно, "скользят" вместе с продвижеением белка по сахарофосфатному остову ДНК. За узнавание, скорее всего, отвечает и часть других полярных контактов с остовом, например контакт через Ser338-His341. Как выяснилось после получения выравнивания, только один из этих остатков консервативен. Поэтому в качестве потенциальных претендентов на специфичное узнавание ДНК возьмем все вывленные скриптом остатки и сведем их в таблицу (см. ниже).

Описание функций исследованного белка

Описание заданного белка в UniProt (AC P00581): ДНК полимераза из бактериофага T7, относится семейству ДНК полимераз А-типа, состоит из двух субъединиц, одна из которых кодируется фагом, а другая - хозяином.
Доменная структура:

Описание соответствующего ДНК-связывающего домена DNA_pol_A в Pfam (PF00476): ДНК полимеразы семейства А обладают полимеразной активностью и связываются с ДНК, осуществляя таким образом процесс репликации.
Проверка аминокислотных остатков на консервативность:
Один из остатков аргинина (Arg111) вообще не вошел в ДНК-связывающий домен, другой (Arg604) оказался не консервативным. Остаток серина оказался консервативными, а гистидина - нет. Консервативными в таком случае должны оказаться другие остатки, участвующие в полярном взаимодействии с цепью.
Выравнивание из Pfam. Нижняя последовательность - наша, остатки, обладающие высокой консервативностью и выявленные скриптом, обозначены синим, менее консервативные - зеленым. Остатки, предсказанные скриптом, nucplot'ом и проверенные на консервативность сведены в таблицу, наиболее консервативные отмечены на структуре другим скриптом:

Остов ДНК в проволочной модели, азотистые основания - розовые, вода - циановая, атомы белка, участвующие в полярном взаимодействии отмечены зеленым, в неполярном - желтым.
Здесь осуществлены контакты с помощью водородных связей, через воду, посредством гидрофобных взаимодействий

Вероятно, именно эти остатки заслуживают внимания как остатки, осуществляющие распознавание ДНК полимеразой молекулы ДНК в процессе репликации (в стадии элонгации), поскольку они обладают способностью образовывать контакты с ДНК (предсказано скриптом и программой nucplot), а также консервативны (в соответствии с выравниванием из Pfam).

Построение схемы контактов белка с ДНК

Программа nucplot, предназначенная для визуализации контактов между ДНК и белком, запускается на сервере kodomo-count. Поскольку программа не принимает на вход pdb-файл с большим числом остатков, на вход был подан файл с ДНК и остатками белка, находящимися в 15-ти ангстремной близости от ДНК. Получено изображение:

Программа выявила чуть меньше контактов, чем скрипт, т.к. не предсказала большинства гидрофобных контактов, хотя полярных контактов предсказала больше. Практически все консервативные остатки, участвующие в образовании полярных контактов, предсказанны совместно скриптом и программой.