На главную страницу третьего семестра

Занятие 4. Поиск сходных нуклеотидных последовательной, не кодирующих белки

Задача — выбрать тРНК у кишечной палочки (Escherichia coli K-12) (аннотированный геном AC U00096) и найти наиболее похожую на нее последовательность в "родственном" геноме сенной палочки (Bacillus subtilis).

Определение тРНК использованной рибосомой при присоединении 4-ого аминокислотного остатка к растущей цепи белка DEOC_ECOLI.

Таблица 1. Выбор т-РНК

Аминокислотный остаток в 4-ой позиции белка DEOC_ECOLI	L (Leucine)
Соответствующий кодон в гене deoC	5'-СUG-3'
Идеальный антикодон	5'-CAG-3'
Сколько можно было бы ожидать разных тРНК для остатка X, если опираться на генетический код?	6
Сколько разных тРНК для остатка X аннотировано в геноме кишечной палочки?	3-5(8)*
Характеристика выбранной для дальнейшего изучения тРНК:
имя гена	leuT
локализация гена в геноме	3980629..3980715
распознаваемый кодон	CUG
антикодон	CAG
Результат поиска всех лейциновых тРНК у Escherichia coli K-12 16033:FT /note="codons recognized: CUR; anticodon: UAG leucine 45077:FT /note="codons recognized: UUR; anticodon: UAA leucine 74863:FT /note="codons recognized: CUY; anticodon: GAG leucine 89809:FT /note="codon recognized: CUG; anticodon: CAG leucine tRNA1; 100907:FT /note="codons recognized: UUR; anticodon: CAA leucine 103309:FT /note="codon recognized: CUG; anticodon: CAG leucine tRNA1; 103321:FT /note="codon recognized: CUG; anticodon: CAG leucine tRNA1; 103333:FT /note="codon recognized: CUG; anticodon: CAG leucine tRNA1;

Комментарии

Для определения количества разных тРНК, используемых E.coli для аминокислотного остатка L, в геноме кишечной палочки ищем строчки со словами codon (codons) и leucine командой
grep -n 'codon.* .eucine' ecoli.embl > codon.txt
В результате получаем список находок: 8 различных гена, кодирующих tRNA для лейцина, среди них точно известно 4 с одним и тем же антикодоном (и кодоном) CAG (CUG) 1 имеет пуриновое и 1 пиримидиновое азотистое основание в первой позиции, 2 имеют кодон UUR (все соответствуют таблице генетического кода). Различных (не копий) тРНК может быть от 3 до 5. Рассмотрим только один из этих генов leuT (можно выбрать любой из четырех одинаковых, т.к. невозможно предположить, что только одна tRNA из четырех участвует в синтезе на рибосоме, скорее всего, они все участвуют).
Антикодон - нуклеотиды 35, 36 и 37 гена тРНК, длина tRNA 86 нуклеотидов.

Поиск гомологичных тРНК в родственном геноме

Задача — найти в геноме Bacillus subtilis последовательность, наиболее похожую на последовательность тРНК из E.coli, выбранную в пункте 1. Поиск проведем с помощью 4-х разных программ для быстрого поиска сходных нуклеотидных последовательностей.

Поиск гомологичной т-РНК


Программа	FASTA	BLASTN	MegaBLAST	discontiguous MegaBLAST
Длина якоря	6	11	28	21*
Результаты поиска
Число находок с E-value < 0,01	0	3	0	2
Характеристика лучшей находки:
AC фрагмента аннотированного генома	Z99106	Z99119	-	Z99119
E-value	0.73	4e-12	-	7e-14
длина выравнивания	35	65	-	68
вес выравнивания	25.7 bits	65.9 bits (33)	-	71.9 bits (36)
координаты в геноме	complement(3412..3477)	complement(159010..159074)	-	complement(159007..159074)
Аннотация лучшей находки по записи EMBL:
имя гена	yclG	trnB-Leu1	-	trnB-Leu1
это тРНК?	Нет, это неизвестный белок	Да	-	Да
это тоже лейциновая тРНК?	-	Да	-	Да

Комментарии

• Для работы создаем индексные файлы к БД:
  formatdb -i bs_genome.fasta -p F -n bs
  
• Затем запускаем BlastN:
  blastall -p blastn -d bs -i trna.fasta -o blastn.txt
  
• Запускаем MegaBlast:
  megablast -d bs -i trna.fasta -o mblast.txt -D 2
  Параметр -e - значение E-value, до которого выдаются находки (по умолчанию 1000000.0). Поскольку программа все равно ничего не нашла, можно не менять это значение. Параметр -F - использование фильтров. Ни при F, ни при T (не использовать, использовать) ничего не нашлось.
• Запускаем discontiguous MegaBlast:
  megablast -d bs -i trna.fasta -o dmblast.txt -e 10.0 -F F -D 2 -t 21 -W 11 -N 1
  Если параметр -N изменить на 2 (т.е. допустить, что наша последовательность может кодировать и белки), то находятся и третья находкв BlastN (хотя этим кодируется tRNA, правда со странным названием: transfer RNA-Leu). А если включить фильтрацию (чтобы объективно сравнивать с BlastN), то у первой находки E-value становится как и у первой находки BlastN (4e-12), а у оставшихся двух - больше, чем при иcпользовании BlastN, но меньше, чем при использовании discontiguous MegaBlast без фильтрации.
  Получается, Fasta не годится для выполнения данной работы, BlastN справляется хорошо (возможно, т.к. гены, кодирующие tRNA, консервативны, а малая длина якоря служит в таких условиях плюсом), MegaBlast не справился (чего и следовало ожидать), а discontiguous MegaBlast, хотя должен справляться лучше, чем BlastN, ввиду не совсем ясных причин (возможно, в tRNA консервативен неразрывный небольшой кусок => длинный паттерн захватывает и неконсервативные участки), выдает меньше находок (не только с малыми E-value), хотя веса этих находок значительно больше.

---

©Хайруллин Альберт