Протокол занятия 9

Исследование контактов между молекулами белка и нуклеиновой кислоты


Таблица. Контакты разного типа в комплексе RFX_DNA_binding (RFX DNA-binding domain) 1DP7
Полярные Гидрофобные Всего
Контакты белка с ...
... остатками 2'-дезоксирибозы 6 44 50
... остатками фосфорной кислоты 24 - 24
... остатками азотистых оснований со стороны большой бороздки 10 10 20
... остатками азотистых оснований со стороны малой бороздки 2 нет 2

С остатком BRU найдено 10 гидрофобных контактов, полярных контактов нет.
Для выполнения этого задания прежде всего был внимательно рассмотрен скаченный pdb-файл и уточнен синтаксис обращения к атомам остатков рибозы, фосфорной кислоты и азотистый оснований.
Затем был загружен предварительно модифицированный (названия осонований были заменены: а на da и т. д.) скрипт dna.def. С помощью этого скрипта были определены следующие множества:
  • base — все атомы оснований ДНК (эквивалентно "(da,dt,dc,dg) and not backbone")
  • mjg — атомы оснований ДНК, обращённые в большую бороздку ("major groove")
  • mig — атомы оснований ДНК, обращённые в малую бороздку ("minor groove")
Так как в структуре есть модифицированные основания BRU (5-бром-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат), то множество атомов ДНК было определено следущим образом: "define dna1 (da,dt,dc,dg), bru".
Далее, поскольку в RasMol это не встроено, были в ручную определены множества полярных и неполярных атомов ДНК. Полярными атомами будем считать все атомы кислорода и азота, а неполярными — все атомы углерода. Тем самым нужные множества определяются так:
  • полярные атомы 2'-дезоксирибозы: "define polar_d *.O?'and dna1"
  • полярные атомы остатков фосфорной кислоты: "define polar_p *.OP? and dna1"
  • полярные атомы азотистых оснований, обращенные в большую (малую) бороздку: "(oxygen,nitrogen) and mjg" (соответственно, "(oxygen,nitrogen) and mig")
  • неполярные атомы 2'-дезоксирибозы: "define nopolar_d *.C?' and dna1" (аналогично "dna1 and backbone and carbon", поскольку все атомы углерода остова ДНК находятся в остатке сахара)
  • неполярные атомы большой бороздки: "carbon and mjg"
  • неполярные атомы малой бороздки: "carbon and mig"
Наконец, с помощью команды select within( <порог расстояния>, <множество>) были посчитаны полярные (порог расстояния 3,5Å) и гидрофобные (порог расстояния 4,5Å) контакты между белком и нуклеиновой кислотой.
Больше всего обнаружилось контактов белка с остатками 2'-дезоксирибозы, а именно гидрофобных контактов. Это объясняется тем, что в молекуле ДНК остатки сахара располагаются снаружи, поэтому являются более доступными для контакта с белком, чем азотистые основания. Молекула 2'-дезоксирибозы содержит больше атомов углерода, поэтому большинство таких контаков гидрофобные. Контакты белка с основаниями имеются только со стороны большой бороздки.

Поиск специфических контактов, обеспечивающих узнавание сайта в молекуле ДНК


По-моему мнению одним из таких специфических контактов в данном комплексе является контакт между остатком лизина (lys45 цепь P) и основаниями цитозина (6 и 7 цепь D). Лизин является гидрофобной, а также полярной аминокислотой. Поэтому данный аминокислотный остаток образует с ДНК и полярные и гидрофобные контакты:
  • lys45P.nz-dc6D.o2 (полярный контакт между О2 дезоксицитидина и NZ из боковой цепи лизина)
  • lys45P.ce-dc7D.c1' (гидрофобный контакт между С1 дезоксицитидина и СЕ из боковой цепи лизина)
  • lys45P.cg-dc7D.c4' (гидрофобный контакт между С4 дезоксицитидина и СG из боковой цепи лизина)
Здесь представлены остаток лизина (lys45) и 6-7 нуклеотиды цепи ДНК. Подписаны атомы, вовлеченные во взаимодействия, описанные выше (расстояния между соответствующими атомами не больше 3,5 Å для полярных контактов, не больше 4,5 Å для гидрофобных).

Описание функций исследованного белка


Описание заданного белка RFX1_HUMAN, представленное в Uni-Prot:
  • MHC class II regulatory factor RFX1 (RFX) (Enhancer factor C) (EF-C)
  • AC P22670
  • ген RFX1
  • длина 979 a. о.

Функции белка: ругуляторный фактор, необходимый для экспрессии генов, принадлежащих к MHC классу II. Присоединяется к Х-боксу этих генов. А также присоединяется к обратному повтору (ENH1), требующимуся для экспресси генов вируса геппатита В, и к альфа-элементу RPL30 промотора. Помимо ДНК-связывающего домена (аминокислотные остатки: 438-528) имеет функционально независимый димеризационный домен (744-979).
Особенности RFX семейства ДНК-связывающих доменов: центральный домен в белках этого семейства, связывается с ssДНК сначала как мономер или как гомодимер.
Судя по выравниванию из Pfam выбранный остаток lys45 является консервативным (108 по координатам полученного выравнивания, в pdb-файле - 45, во всем белке - 482). При сравнении последовательностей белка в полученном выравнивании и в pdb-файле оказалось, что искомый домен содержится в файле с 438 по 513 остатки (координаты в pdb-файле: 1-76). Таким образом последних 16 аминокислотных остатков домена (до 528) в структуре белка, описанной в 1DP7_2.pdb, нет. То есть при кристаллизации данного комплекса в процессе ренгеноструктурного анализа, эти остатки просто не зафиксировались.

Построение схемы контактов белка с ДНК

Программа nucplot была зупущена командой nucplot 1DP7_2m_1.pdb. Исходный файл 1DP7_2.pdb был модифицирован в 1DP7_2m_1.pdb, при этом были проведены замены оснований: A вместо DA (и аналогично для остальных азотистых оснований), и также были удалены строчки MODEL 1, MODEL 2 и ENDMDL. Последнее было сделано потому, что программа строила изображение только одной цепи белка (и ДНК соответственно), в то время как их две симметричных. Видимо в этом и заключалась ошибка программы.
В результате была получена следующая схема контактов ДНК и белка:

Таким образом наличие выбранного мною контакта (lys45-C6) подтверждается существованием водородной связи у атома лизина NZ. Отсюда можно сделать вывод, что выбранный контакт действительно может отвечать за специфичность узнавания белком ДНК.
Вернуться на страничку третьего семестра

© Головкина Мария Сергеевна